DLS 方法開發(fā)和驗證（下）

DLS方法開發(fā)和驗證（下）1.

方法驗證分析方法驗證是證明分析程序適合其預(yù)期目的的過程5。并非所有驗證特征都適用于粒度分析。較早的FDA工業(yè)指南（非實施）草案文7包括一個專門針對粒度分析的部分。盡管較新的已發(fā)布文件取代了較舊的指南草案，但有關(guān)粒度分析的較舊部分提供了有關(guān)粒度分析與其他技術(shù)（如HPLC）的不同之處的見解。舊文檔中的以下聲明有助于方法驗證工作：“方法驗證通常涉及中間精度和重復(fù)性的評估。應(yīng)保證生成的數(shù)據(jù)是可重復(fù)的，并控制產(chǎn)品的質(zhì)量?！?考慮到這一評論，下面提供了解決DLS方法驗證的建議：●特異性：N/A，DLS檢測大小變化但對不同化學(xué)物質(zhì)不敏感?！窬€性：N/A，DLS沒有任何線性關(guān)系?！駵?zhǔn)確性：N/A，儀器的準(zhǔn)確性使用標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行驗證，但常規(guī)定量裁判方法（SEM/TEM顯微鏡）不包括準(zhǔn)確性確定。包括樣品的SEM/TEM圖像以支持方法驗證可能是更合適的?！窬芏龋ㄖ貜?fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）：這是需要重點關(guān)注的地方。通常這些術(shù)語的定義在粒度分析領(lǐng)域可能不同于其他技術(shù)。以下評論來自粒度分析領(lǐng)域：

重復(fù)性：多次測量樣品。

重現(xiàn)性：準(zhǔn)備樣品、測量、丟棄、清潔、重復(fù)。建議的方法是制備五份樣品，然后對每個樣品進(jìn)行五次分析。

中間精密度：此活動涉及第二位分析員、第二臺儀器或兩者兼而有之。如果所有測試都在一個地點進(jìn)行，則由同一系統(tǒng)上的不同操作員在不同日期分析同一批次的樣品。如果要在多個地點進(jìn)行測試，則同一樣本（或批次）由不同操作員在不同地點的不同系統(tǒng)上進(jìn)行分析?！穹秶篘/A，僅在所用系統(tǒng)的工作范圍內(nèi)工作。無需對此進(jìn)行測試或記錄。●定量限：N/A，這只是測試粒徑。●檢測限：N/A，方法開發(fā)應(yīng)確保樣品在系統(tǒng)檢測限內(nèi)。2.

結(jié)構(gòu)示例兩名操作員在兩個NicompDLS系統(tǒng)上分析了一種藥物物質(zhì)（異丙酚乳劑）。該樣品已過期，但仍顯示符合USP<729>的合格結(jié)果。儀器設(shè)置如下：InstrumentA：InstrumenttypeNicomp3000Age5yearsoldLaserpower35mWDetectorPMTDetectorangle90°SoftwareversionZPW388V2.17.0215InstrumentB：InstrumenttypeNicomp3000AgenewLaserpower35mWDetectorPMTDetectorangle90°SoftwareversionZPW388V2.17.02153.

方法開發(fā)首先分析92nmPSL標(biāo)準(zhǔn)以確保適當(dāng)?shù)南到y(tǒng)性能。測量結(jié)果在預(yù)期值的98%以內(nèi)。建議在開始此類工作之前進(jìn)行此驗證測試。接下來進(jìn)行快速研究以測試濃度（稀釋）的影響。參見圖1中的結(jié)果。遵循這些指南的內(nèi)容，DLS規(guī)格（根據(jù)定義尺寸小于10μm）對于強(qiáng)度平均值可以是可重復(fù)的±20%，對于PI或其他計算結(jié)果指示分布寬度是可重復(fù)的±30%。對于某些藥品，這可能是一個可以接受的范圍，但要注意當(dāng)粒徑非常小時出現(xiàn)的統(tǒng)計問題。如果平均粒徑為500nm，±20%，則范圍為400–600nm，這還不錯。但對于平均粒徑為10nm的蛋白質(zhì)，范圍則為8-12nm，這樣的粒徑跨度變得非常挑戰(zhàn)且難以接受。將10滴樣品加入15mL去離子水中并進(jìn)行分析。重復(fù)相同的制備。然后將這些樣品按2:1稀釋并進(jìn)行分析。樣品看起來太渾濁，結(jié)果發(fā)生變化，因此將下一滴添加到15mLDI水中。樣品出現(xiàn)輕微混濁，這些結(jié)果是可以接受的。有時，稀鹽溶液是比純?nèi)ルx子水更好的稀釋劑。下一步是將一滴樣品加入10mL過濾后的10mMKCl溶液中。這些結(jié)果似乎更好，因此10mMKCl溶液用于本研究中的所有其他測量。在進(jìn)行稀釋研究時，分析時間也從3分鐘到10分鐘不等。三分鐘、五分鐘和十分鐘分析時間的時間曲線圖如圖2-4所示。紅色=光強(qiáng)粒徑平均值，藍(lán)色=體積粒徑平均值，藍(lán)色=數(shù)量粒徑平均值。該方法選擇了5分鐘的分析時間。在五分鐘的分析時間完成之前，光強(qiáng)平均粒徑結(jié)果已經(jīng)穩(wěn)定下來。但直到大約9分鐘前，體積和數(shù)量加權(quán)平均結(jié)果仍在變化。這是也是在使用DLS時僅選擇光強(qiáng)粒徑結(jié)果的一個原因。這可能是方法開發(fā)中測試重復(fù)性很好的一個點。在這種情況下，也許下一個測試的分析時間是四分半、五分和五分半鐘。在這項研究中沒有執(zhí)行這一步驟，值得指出的是，整個方法開發(fā)和驗證研究在不到8個小時內(nèi)完成。更嚴(yán)格的最終發(fā)布測試方法開發(fā)和驗證方法很可能需要至少幾天時間。4.

樣品準(zhǔn)備——在干凈的瓶子里裝滿10毫升過濾后的KCl溶液——用針頭注射器取出0.5毫升異丙酚——在瓶子里注入1滴異丙酚和10毫升KCl溶液——手旋轉(zhuǎn)直到混合(10秒)——用一次性移液管將400μL樣品移入圓形一次性玻璃樣品池——將玻璃樣品池放入黑色Holder支架·在Nicomp上打開樣品蓋——將樣品池和支架插入Nicomp系統(tǒng)，Holder支架背向Nicomp的左側(cè)——關(guān)閉Nicomp上的樣品蓋確保儀器設(shè)置與如下所示的值匹配：Temp23℃Viscosity0.933cPLiquidindexofrefraction1.333Intensitysetpoint300KHzFirstchannelusd2Externalfiberangle90°Scatteringangle90°PrintmolecularweightuncheckedAutosetchannelwidthcheckedAutosetsensitivitycheckedAutonicompparametercheckedAutobaselineadjustcheckedCum%setpoint10%AutodilutionNDpositionN/ANumberofprint/savecycles5Usingruntime5minutesUsingfiterroruncheckedClearautocorrelatoruncheckedPrintresultuncheckedAutomaticchoiceofdistributionuncheckedStoredataondiskcheckedOverwriteoldfileuncheckedSavedatalogchecked——單擊綠色“G”圖標(biāo)開始測量——打印并記錄平均直徑、標(biāo)準(zhǔn)偏差、PI、D10、D50和D90——將結(jié)果輸入Excel電子表格——計算五項分析的平均值和變異系數(shù)——比較兩個數(shù)據(jù)集5.

結(jié)果樣品在A和B系統(tǒng)上獨立制備和分析。每個樣品分析五次以檢查重復(fù)性。這兩個系統(tǒng)的示例結(jié)果如圖5和圖6所示。整個結(jié)果以表格形式顯示在圖7和圖8中。五個結(jié)果的疊加如圖所示。6.

結(jié)論查看綜合結(jié)果可以得出以下幾點觀察結(jié)果：——即使是相隔數(shù)年生產(chǎn)的兩個系統(tǒng)也會生成相似的數(shù)據(jù)——兩個系統(tǒng)之間存在明顯的3%偏差——PI計算可能不是用于定義寬度分布的最佳值——如果使用PI，則30%的差值似乎是合適的——D10、D50、D90結(jié)果顯示出更好的重現(xiàn)性，可能更容易為制藥行業(yè)所接受純粹基于該數(shù)據(jù)集，基于三個測量的該藥物產(chǎn)品的規(guī)格可能類似于：——光強(qiáng)平均值=200nm±20%，COV=小于20%——D10=140nm±30%，COV=小于30%——D90=284nm±30%，COV=小于30%或——PI=0.09±30%上述建議規(guī)格僅來自觀察到的重現(xiàn)性，可能對藥物安全性或有效性沒有任何影響。USP<729>中的實際是否通過標(biāo)準(zhǔn)的要求只是粒徑尺寸必須低于500nm并且具有低x2值。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的另一種方法可能是關(guān)注影響有效性和/或安全性的粒徑大小。本技術(shù)說明收集的數(shù)據(jù)是讓您了解DLS技術(shù)對于簡單樣品的可重復(fù)性/重現(xiàn)性7.

儀器介紹參考資料1USP<729>,GlobuleSizeDistributioninLipidInjectableEmulsions2ISO22412Particlesizeanalysis—Dynamiclightscattering(DLS)3USP<429>,LightDiffractionMeasurementofParticleSize4EntegrisTechnicalNote,DLSSamplePreparation5AnalyticalProceduresandMethodsValidationforDrugsandBiologics,July20156EntegrisTechnicalNote,DLSSystemVerification