木霉對(duì)黃瓜枯萎病防治效果及幼苗防御酶活性的影響

木霉對(duì)黃瓜枯萎病防治效果及幼苗防御酶活性的影響

作為一種重要的植物疾病的生防菌，木霉已引起人們的廣泛關(guān)注，但木菌生防機(jī)制的研究主要集中在對(duì)病原體的抗逆作用上。DeMeyer等利用哈茨木霉T39接種根部或葉子,控制了灰葡萄孢引起的病害,認(rèn)為誘導(dǎo)抗性是重要機(jī)制之一。Yedidia等也證實(shí)了哈茨木霉菌株T203穿透到黃瓜根部產(chǎn)生了一種類似的誘導(dǎo)抗性,Jean-Berchmans等用木霉菌處理水稻種子并接種稻瘟病菌或白葉枯病菌,使水稻幼苗過氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶活性增強(qiáng),在某一時(shí)段顯著高于未經(jīng)木霉處理的對(duì)照。為了明確木霉菌與植物抗病代謝活動(dòng)的關(guān)系,本試驗(yàn)對(duì)木霉菌分生孢子(conidiospores)和厚垣孢子(chlamydospores)處理黃瓜幼苗,對(duì)黃瓜枯萎病防治效果及根系幾種主要防御酶活性的影響進(jìn)行了初步研究,為進(jìn)一步深入研究木霉菌的生防機(jī)理奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1生防木霉菌株篩選供試黃瓜品種為山東密刺。種子采用常規(guī)消毒處理,經(jīng)催芽后播于育苗盤內(nèi),育苗營養(yǎng)土經(jīng)121℃高壓滅菌2h,待黃瓜長出3~4片真葉后供接菌試驗(yàn)。供試病原真菌為黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumOwen),由本實(shí)驗(yàn)室從沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜枯萎病株上分離獲得,經(jīng)繁殖培養(yǎng)后制成孢子懸浮液用于侵染接種,孢子濃度2×106個(gè)/mL。供試的生防木霉菌TrichodermavirideT23為沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物農(nóng)藥工程中心經(jīng)室內(nèi)拮抗性測(cè)定和田間防效試驗(yàn)篩選獲得,為生防制劑的主要菌株。繁殖培養(yǎng)后制成孢子懸浮液用于灌根,分生孢子濃度為5×107個(gè)/mL,厚垣孢子濃度為2×106個(gè)/mL。1.2黃瓜枯病接菌試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理:(1)接種木霉菌分生孢子(CS);(2)接種木霉菌分生孢子2d后接黃瓜枯萎病菌(CS+F);(3)接種木霉菌厚垣孢子(ChS);(4)接種木霉菌厚垣孢子2d后接黃瓜枯萎病菌(ChS+F);(5)接種黃瓜枯萎病菌(FCK)。木霉菌接種量為每株灌孢子懸浮液50mL,枯萎病菌每株接孢子懸浮液10mL。接菌方法:用打孔器在距黃瓜苗根部2cm處土壤開一孔,用注射器將鐮刀菌孢子懸浮液注入根部。每處理34株,隨機(jī)排列,3次重復(fù)。分別于接種木霉菌后的第1、3、5、7、10、13、16d取黃瓜根系,用蒸餾水沖洗干凈并用濾紙吸干水份,每處理準(zhǔn)確稱取1g裝袋,放入-20℃低溫冰箱中保存。處理30d后進(jìn)行病害調(diào)查。1.3抗病性相關(guān)酶活性測(cè)定1.3.1石英砂酶粗提液的制備將1g樣品,放入預(yù)冷的研缽中,加入1.5mL硼酸緩沖液及0.2g石英砂,冰浴中研磨成勻漿,再用1.5mL緩沖液沖洗研缽及缽棒2次合并入離心管,15000r/min離心20min,上清液即為酶粗提液。-20℃低溫保存。1.3.2流量法的測(cè)定苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)及過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定參照陳捷等和劉限的方法。2結(jié)果與分析2.1幾種黃瓜病菌檢出情況試驗(yàn)結(jié)果表明:盆栽黃瓜經(jīng)綠色木霉菌T23的分生孢子和厚垣孢子處理,病情指數(shù)分別為1.77和2.84,表現(xiàn)為輕微發(fā)病,只接種黃瓜枯萎病菌孢子懸浮液,而未經(jīng)木霉菌處理的對(duì)照發(fā)病嚴(yán)重,病情指數(shù)達(dá)33.69,發(fā)病率達(dá)63.89%;經(jīng)木霉菌T23的分生孢子和厚垣孢子灌根處理后再接入枯萎病菌,病情指數(shù)分別降至13.12和10.28,發(fā)病率降低為27.78%和26.39%,與對(duì)照相比差異顯著,相對(duì)防效分別為61.06%和69.48%(表1)。2.2木霉分生菌和厚源菌對(duì)黃瓜的酶活性的影響2.2.1厚垣對(duì)接枯菌酶活性的影響用木霉菌不同孢子制劑對(duì)黃瓜灌根處理,根系內(nèi)PAL活性在接菌后均有所上升。其中分生孢子處理的酶活高峰出現(xiàn)得早,第3d其峰值為對(duì)照的2.24倍,之后下降并在第7d出現(xiàn)峰谷,其值仍然高于對(duì)照,16d又出現(xiàn)一明顯酶活高峰。但分生孢子處理后接枯萎病菌的則酶活性變化不明顯。厚垣孢子處理的酶活峰值出現(xiàn)得較晚,至16d才出現(xiàn)明顯的酶活高峰。厚垣孢子處理后接枯萎病菌的酶活性在第10d出現(xiàn)最大峰值,為對(duì)照的2.75倍。與分生孢子相比,厚垣孢子的PAL酶活高峰出現(xiàn)較晚,但活性更強(qiáng)。而對(duì)照處理的酶活高峰出現(xiàn)晚、峰值低(圖1)。分生孢子和厚垣孢子處理黃瓜根部,PAL表現(xiàn)敏感,尤其厚垣孢子處理后,PAL表現(xiàn)更為敏感。表明木霉菌對(duì)黃瓜抗枯萎病與PAL活性密切相關(guān)。2.2.2厚垣對(duì)接枯菌酶活性的影響用分生孢子處理后,黃瓜根系POD酶活呈現(xiàn)上升,在第3d達(dá)到一活性高峰,峰值是對(duì)照的3.25倍,然后下降并在第10d出現(xiàn)第2個(gè)酶活高峰,峰值與前一高峰接近,之后下降。分生孢子處理后接枯萎病菌的酶活性在處理前期不明顯,第10d出現(xiàn)一活性高峰之后下降進(jìn)入峰谷。厚垣孢子處理初期急劇下降并到達(dá)峰谷,之后呈逐漸上行趨勢(shì),10~13d稍有下降,在第16d達(dá)到最大酶活高峰,峰值是對(duì)照的2.49倍。用厚垣孢子處理后接枯萎病菌的酶活性,在5、10、16d共出現(xiàn)3次高峰,其峰值接近。對(duì)照處理的POD活性始終趨于平穩(wěn),并處于一個(gè)較低水平(圖2)。2.2.3不同濃度3-d厚垣對(duì)接枯菌酶活性的影響2種木霉菌孢子灌根或灌根后接枯萎病菌,PPO活性均在接種處理的初期呈現(xiàn)上升,在第3d出現(xiàn)一明顯的酶活高峰,之后下降又上升,單接分生孢子和厚垣孢子均在第10d出現(xiàn)第2次酶活高峰。分生孢子處理后接枯萎病菌的酶活性在第3d出現(xiàn)一小高峰,第5d降至峰谷,隨后趨于平穩(wěn)。厚垣孢子處理后接枯萎病菌的酶活性在接菌后出現(xiàn)一小高峰,從第5d開始酶活性加速上升,并在第13d到達(dá)最大峰值589.93U·mg-1protein,比對(duì)照高2.42倍。而對(duì)照處理的PPO活性均趨于平穩(wěn)(圖3)。表明木霉菌接種后可引起黃瓜體內(nèi)PPO活性的增強(qiáng),進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)病原菌有毒的醌類物質(zhì),尤其木霉菌厚垣孢子誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生對(duì)枯萎病菌的抗性與PPO活性關(guān)系更大。2.2.4nad活性的變化試驗(yàn)結(jié)果表明:木霉菌可誘導(dǎo)黃瓜體內(nèi)的CAT活性增強(qiáng)。分生孢子和厚垣孢子單獨(dú)接種黃瓜根部,均在處理后出現(xiàn)CAT活性的顯著升高,其第3d峰值是對(duì)照的4.14倍和4.44倍,之后趨于平穩(wěn),并與對(duì)照一樣一直保持較低水平,無明顯差異。厚垣孢子處理后接枯萎病菌的酶活性從第7d開始上升,到第10d出現(xiàn)明顯峰值,為對(duì)照的10.45倍,并于16d再次上升至301.06U·mg-1protein,為對(duì)照的15.84倍(圖4)。3結(jié)論和討論3.1不同處理對(duì)黃瓜幼苗抗氧化酶活性的影響大量研究表明PAL、POD、PPO與植物抗病過程密切相關(guān)。PAL是酚類物質(zhì)、植保素和木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶。植物在受到病原菌侵染或激發(fā)子刺激后PAL活性會(huì)首先上升;POD催化脂肪族、芳香族和酚類物質(zhì)的氧化,是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶,其活性的增加標(biāo)志著木質(zhì)素的加速合成和抗性的產(chǎn)生;PPO能將酚類物質(zhì)氧化成對(duì)病原菌有毒的醌類物質(zhì);CAT在清除自由基、阻止自由基的形成和延緩植物衰老等方面起著重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明:經(jīng)木霉菌處理并挑戰(zhàn)接種黃瓜枯萎病菌后,在一定程度上控制了黃瓜幼苗枯萎病的病情指數(shù)及發(fā)病率,黃瓜幼苗根系幾種防御酶活性均有所上升。先接木霉菌再接種枯萎病菌,酶活升高更明顯,可能是因?yàn)槟久咕幚砗蠹ぐl(fā)了植物體內(nèi)的抗性反應(yīng)所致。3.2制備綠木霉菌t3木霉菌分生孢子處理黃瓜幼苗,其酶活高峰出現(xiàn)得早,但厚垣孢子比分生孢子的酶活峰值更高。厚垣孢子處理的酶活性高峰大多出現(xiàn)在接種枯萎病菌之后,并多表現(xiàn)為緩慢升高并最終達(dá)到最大峰值,表明厚垣孢子誘導(dǎo)抗性的發(fā)生是一個(gè)逐漸的過程,可能與木霉菌分生孢子和厚垣孢子在土壤中的萌發(fā)速度、定殖能力以及在黃瓜根表的定殖過程有關(guān)。而厚垣孢子作為一種抗逆類型的孢子形態(tài),本身具有抵抗高溫、低溫、干燥及營養(yǎng)缺乏等不良環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)所用綠色木霉菌T23,可通過液體發(fā)酵產(chǎn)生大量厚垣孢子,將此厚垣孢子用滅菌硅藻土吸附并制成制劑,于室溫下保存2年,孢子仍然能夠萌發(fā)。與分生孢子相比木霉菌厚垣孢子具有更深遠(yuǎn)的生態(tài)學(xué)意義和更廣闊的生防應(yīng)用前景。3.3黃瓜木霉菌的抗菌活性瓜類枯萎病是當(dāng)前生產(chǎn)上最難防治的土傳病害之一,尤其是保護(hù)地種植,土壤含菌量