生物有機(jī)肥對(duì)香蕉枯萎病的田間防治效果

生物有機(jī)肥對(duì)香蕉枯萎病的田間防治效果

香蕉萎縮，也稱為bana疾病和香蕉黃葉病，是一種毀滅性的土傳病，嚴(yán)重威脅著我國(guó)香蕉業(yè)的發(fā)展。該病是由尖胞鐮刀菌古巴?；虵usariumoxysporumf.sp.cubense侵染所致。在化學(xué)防治上多采用灌根的方式,由于未有特效或高效的化學(xué)藥劑,防治效果不理想,而且防治成本高,殘留期較長(zhǎng),影響生態(tài)環(huán)境,使用生防菌劑對(duì)香蕉枯萎病進(jìn)行生物防治己成為目前的研究熱點(diǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)許多微生物對(duì)香蕉枯萎病菌具有拮抗作用,木霉菌Trichodermasp.對(duì)多種植物病原菌都有較強(qiáng)的拮抗作用,具有生長(zhǎng)繁殖速度快、能迅速占領(lǐng)營(yíng)養(yǎng)空間、可產(chǎn)生抗菌素等多種特點(diǎn),Thangavelu等研究,哈茨木霉對(duì)香蕉枯萎病菌的菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用,防治效果達(dá)48%~51%,有的甚至達(dá)60.7%。Perze-Vicente等研究指出,將施用哈茨木霉菌和種植香蕉耐病品種相結(jié)合,對(duì)香蕉枯萎病的防效可達(dá)95%以上。枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis抑制植物病原菌的范圍很廣,是一種理想的生防微生物。Thangavelu等從香蕉根圍土壤中分離出對(duì)香蕉枯萎病菌絲生長(zhǎng)具有顯著抑制作用的枯草芽胞桿菌,防治效果可達(dá)41%。王振中等從香蕉體內(nèi)分離到的地衣芽胞桿菌Bacilluslicheniformis,溫室防治效果為80%。楊秀娟等從土壤中分離到的芽胞桿菌,能在香蕉植株體內(nèi)定殖,具有很好的防病和促生作用。付業(yè)勤等從香蕉健康植株中分離獲得芽胞桿菌對(duì)香蕉枯萎病菌抑制率在80%以上。生物有機(jī)肥不僅含有豐富的有益微生物,而且具有一定的抑病效果,同時(shí)還是吸附生防菌劑的良好載體。何欣等研究將生物有機(jī)肥與綠色木霉菌和多粘芽胞桿菌混合施用,可有效降低香蕉枯萎病的病情指數(shù);張志紅等研究將枯草芽胞桿菌、膠質(zhì)芽胞桿菌和巨大芽胞桿菌混合菌劑與有機(jī)肥結(jié)合,防病效果達(dá)61.5%。施肥防病是近幾年發(fā)展起來(lái)的前沿技術(shù),它改變了傳統(tǒng)的生物防治方法,為香蕉枯萎病的防治提供了一種新的途徑。本研究是將2種功能菌與腐熟堆肥結(jié)合,制成不同生物有機(jī)肥,應(yīng)用到接種香蕉枯萎病菌的土壤中,分析其對(duì)香蕉枯萎病的防治效果,并從抗性相關(guān)酶、微生物群落結(jié)構(gòu)變化和微生物生物量等方面對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行初步探討,為生物有機(jī)肥和有關(guān)生防菌在香蕉枯萎病的生物防治應(yīng)用研究方面提供理論和實(shí)踐依據(jù)。1材料和方法1.1材料及分析方法供試香蕉為巴西蕉杯苗,由廣東省農(nóng)科院果樹研究所香蕉組培苗中心提供。供試生物有機(jī)肥由廣東省農(nóng)科院果樹研究所自行研制。該生物有機(jī)肥由粉碎的香蕉廢棄莖稈和雞糞按一定比例混合后,加入微生物菌劑經(jīng)生物發(fā)酵堆制腐熟而成。生物有機(jī)肥中含有效活菌數(shù)9.3×108cfu·g-1,含有機(jī)質(zhì)34%、總養(yǎng)分(N、P2O5、K2O)8.3%、pH7.2。所用生防菌為廣東省農(nóng)科院果樹研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選的3株綠色木霉菌Trichodermaviride和1株枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis。3株綠色木霉菌T-40、T-58、T-109(按實(shí)驗(yàn)室編號(hào))篩選于香蕉園中根際土壤,按文獻(xiàn)的方法進(jìn)行分離和鑒定;枯草芽胞桿菌菌株KC-104(按實(shí)驗(yàn)室編號(hào)),以香蕉根、莖、葉為材料進(jìn)行篩選,其菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征的觀察及生理生化指標(biāo)的測(cè)定參考文獻(xiàn)中的檢測(cè)方法及檢索表要求依序檢測(cè)及鑒定。香蕉枯萎病菌為尖胞鐮刀菌Fusariumoxysporum古巴?；?號(hào)生理小種(FOC4),由廣東省農(nóng)科院果樹研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。供試土壤采自廣東省東莞市洪梅鎮(zhèn)農(nóng)科站香蕉實(shí)驗(yàn)地,其基本性狀為:pH5.27,有機(jī)質(zhì)含量為6.6g·kg-1,水解氮183.0mg·kg-1,有效磷61.4mg·kg-1,速效鉀530mg·kg-1。測(cè)定方法參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》。土壤經(jīng)消毒后接種香蕉枯萎病菌孢子懸液,使土壤中香蕉枯萎病菌孢子濃度達(dá)到1×105cfu·g-1土以上的發(fā)病濃度。1.2試驗(yàn)方法11.2.1生物有機(jī)化合物和防菌藥物的制備1.3香蕉植株根際土壤的取樣試驗(yàn)期間,各處理盆栽管理措施一致。病原菌接種后第25d開(kāi)始觀察香蕉苗發(fā)病情況,每隔5d調(diào)查記錄1次,調(diào)查至第50d。根尖取樣:將根系泥土用自來(lái)水沖掉,再用去離子水清洗一遍,之后剪取香蕉植株根尖2cm,用于β-1,3-葡聚糖酶的測(cè)定。土壤取樣:試驗(yàn)結(jié)束時(shí)將粘在香蕉植株根系上的土壤抖落后,將根稱重,按每10g加90mL無(wú)菌水的比例放入事先裝有玻璃珠的三角瓶中,再將三角瓶放置在搖床上170r·min-1震蕩20min,洗脫在無(wú)菌水中的土壤即為根際土壤;將盆栽土壤充分混勻后,取500g混合樣,即為土體土壤。根際土壤和土體土壤用于土壤微生物及病原菌數(shù)量的測(cè)定,土體土壤用于土壤微生物生物量的測(cè)定。1.4菌株的測(cè)定病情指數(shù)和防病效果:病情分級(jí)參照張志紅等的方法。病情指數(shù)=∑(各級(jí)發(fā)病數(shù)×該級(jí)代表數(shù))/總數(shù)×最高級(jí)代表值×100防病效果=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100%β-1,3-葡聚糖酶的測(cè)定:按照參考文獻(xiàn)的方法。土壤微生物測(cè)定:采用稀釋平板計(jì)數(shù)法,細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;真菌采用馬丁氏培養(yǎng)基;放線菌采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基。病原菌(FOC4)測(cè)定采用景曉輝等提出的培養(yǎng)基和方法。土壤微生物生物量(SMB)的測(cè)定:微生物量碳、氮測(cè)定采用氯仿熏蒸0.5mol·L-1K2SO4提取法,分別用重鉻酸鉀氧化法和凱氏定氮法測(cè)定提取液中的碳、氮。1.5統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel和SPSS13.0軟件處理。2結(jié)果與分析2.1生物有機(jī)肥等為新防菌劑對(duì)香蕉枯渙病有一定抑制作用香蕉苗發(fā)病初期,各處理的病情指數(shù)均低于對(duì)照處理(圖1),第25d調(diào)查時(shí),生物有機(jī)肥+混合木霉菌劑處理的病情指數(shù)為5,生物有機(jī)肥+單株木霉菌劑處理的病情指數(shù)為7.5,生物有機(jī)肥+枯草芽胞桿菌劑處理的病情指數(shù)為2.5,分別比對(duì)照處理低77.8%、66.7%、88.9%,生物有機(jī)肥(不加生防菌劑)處理的病情指數(shù)也比對(duì)照處理低55.6%,說(shuō)明生物有機(jī)肥加生防菌的處理和單施生物有機(jī)肥的處理對(duì)香蕉枯萎病均有一定的抑制作用。隨著香蕉苗的生長(zhǎng),各處理病情指數(shù)都在上升,至第50d調(diào)查時(shí),生物有機(jī)肥+混合木霉菌劑處理的病情指數(shù)最低,為27.5,比對(duì)照處理降低了50.0%,生物有機(jī)肥+單株木霉菌劑處理和生物有機(jī)肥+枯草芽胞桿菌劑處理的病情指數(shù)分別為37.5和32.5,比對(duì)照處理分別降低了31.8%和40.9%。防病效果以生物有機(jī)肥+混合木霉菌劑處理為最高,達(dá)到了49.6%;生物有機(jī)肥+枯草芽胞桿菌劑處理次之,達(dá)到了40.9%,生物有機(jī)肥+單株木霉菌劑處理為31.8%;單施生物有機(jī)肥處理防病效果僅為18.2%(圖2)。各處理之間差異顯著(P<0.05)。2.2真菌對(duì)植物的抗菌作用β-1,3-葡聚糖酶是植物抗真菌病的重要抗性物質(zhì)之一,可被多種生物因子和非生物因子誘導(dǎo)產(chǎn)生,當(dāng)外來(lái)因素刺激時(shí),如病原菌對(duì)植物的侵染等,可以誘導(dǎo)植物β-1,3-葡聚糖酶的產(chǎn)生以及快速積累,是植物抵抗病原真菌侵染的主要防衛(wèi)反應(yīng)之一。施用生物有機(jī)肥加生防菌的處理顯著提高了香蕉植株根尖β-1,3-葡聚糖酶的活性(P<0.05),其中生物有機(jī)肥+混合木霉菌劑處理的酶活性最高,比對(duì)照提高了37.13%,生物有機(jī)肥+單株木霉菌劑處理和生物有機(jī)肥+枯草芽胞桿菌劑處理分別比對(duì)照提高了18.95%和22.39%,差異顯著(P<0.05)。說(shuō)明生防功能菌木霉菌劑和枯草芽胞桿菌劑的施用,可以誘導(dǎo)香蕉植株根尖植物β-1,3-葡聚糖酶的產(chǎn)生,明顯提高β-1,3-葡聚糖酶的活性,從而使植株產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性(圖3)。2.3不同處理對(duì)土體土壤微生物數(shù)量的影響施用生物有機(jī)肥對(duì)香蕉根際土壤和土體土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯的影響。根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量顯著增加,真菌數(shù)量和香蕉枯萎病病原菌(尖孢鐮刀菌)數(shù)量有所減少,與對(duì)照處理比較,生物有機(jī)肥+混合木霉菌劑處理、生物有機(jī)肥+單株木霉菌劑處理和生物有機(jī)肥+枯草芽胞桿菌劑處理的根際土壤細(xì)菌數(shù)量分別增加了4.30倍、2.75倍和3.20倍,放線菌數(shù)量分別增加了2.28倍、2.33倍和2.14倍,真菌數(shù)量分別減少了19.38%、23.26%和19.07%,病原菌數(shù)量分別下降了80.27%、2.18%和74.73%;土體土壤中微生物數(shù)量與根際土壤中的數(shù)量變化有所不同,細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量均顯著增加,病原菌數(shù)量顯著減少,處理間差異顯著。與對(duì)照處理比較,生物有機(jī)肥+混合木霉菌劑處理、生物有機(jī)肥+單株木霉菌劑處理和生物有機(jī)肥+枯草芽胞桿菌劑處理的土體土壤細(xì)菌數(shù)量分別增加了6.38倍、6.37倍和4.80倍,放線菌數(shù)量分別增加了10.5倍、14.35倍和10.77倍,真菌數(shù)量分別增加了27.77%、37.85%和11.61%,病原菌數(shù)量分別下降了79.82%、2.75%和74.02%;施用生物有機(jī)肥處理對(duì)根際土壤細(xì)菌數(shù)量的影響遠(yuǎn)高于對(duì)土體土壤的影響,兩者相差一個(gè)數(shù)量級(jí)(表1)。2.4生物有機(jī)肥加生防菌土壤微生物量碳(SMBC)是土壤碳素循環(huán)中的重要環(huán)節(jié),是土壤碳素循環(huán)的的驅(qū)動(dòng)力,同時(shí)也是反映土壤微生物量大小的最重要指標(biāo)。土壤微生物量氮(SMBN)是重要的土壤活性氮素資源,直接調(diào)節(jié)土壤氮素供給。生物有機(jī)肥加生防菌處理與對(duì)照處理相比SMBC和SMBN都有顯著增加,其中SMBC增加了760~780mg·kg-1,SMBN增加了13.2~15.8mg·kg-1,且差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。單施生物有機(jī)肥處理與對(duì)照處理相比差異也達(dá)到顯著水平(P<0.05)。說(shuō)明施用生物有機(jī)肥有利于土壤微生物的活動(dòng),可增加土壤微生物活性和數(shù)量。其原因可能是生物有機(jī)肥改善了土壤養(yǎng)分條件,土壤微生物活動(dòng)旺盛,有利于微生物的繁殖,從而增加土壤微生物生物量(表2)。3生物有機(jī)肥利用對(duì)香蕉幼苗根、-1,3-葡聚糖酶活性的影響本研究結(jié)果表明,生物有機(jī)肥+混合木霉菌劑、生物有機(jī)肥+枯草芽胞桿菌劑、生物有機(jī)肥+單株木霉菌劑3個(gè)處理對(duì)病原菌起到了較好的抑制作用,顯著降低了香蕉植株的病情指數(shù),防治效果明顯,其中以生物有機(jī)肥+混合木霉菌劑的處理效果最好,防治效果達(dá)到了49.6%。這可能是由于生物有機(jī)肥中所含的高效拮抗菌在香蕉根際定殖后,保護(hù)香蕉根系免受病原菌侵入,從而降低了病情指數(shù),提高了防治效果。植物防御酶的誘導(dǎo)產(chǎn)生與植物抗性機(jī)制關(guān)系密切。β-1,3-葡聚糖酶是植物抗真菌病中重要的抗病性物質(zhì)之一,它能破壞病原菌細(xì)胞壁,并通過(guò)從病原菌細(xì)胞壁中釋放激發(fā)子誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。β-1,3-葡聚糖酶在植物根尖等幼嫩部分的活性很低,此酶經(jīng)誘導(dǎo)后,活性可以迅速提高。木霉菌也能產(chǎn)生多種不同類型的葡聚糖酶,大多數(shù)木霉菌株經(jīng)誘導(dǎo)所產(chǎn)的β-1,3-葡聚糖酶的活性較高,楊合同等測(cè)定了34株木霉菌株的β-1,3-葡聚糖酶的活性,其中活性高于1000U的有15株,活性在500~1000U的有12株?？莶菅堪麠U菌也能使植株幼苗根部的β-1,3-葡聚糖酶等抗性相關(guān)酶系的活性有不同程度的增強(qiáng),徐韶等用內(nèi)生枯草芽胞桿菌處理甜瓜幼苗根部,β-1,3-葡聚糖酶等抗性相關(guān)酶系的活性有所提高,并且比單獨(dú)接種甜瓜枯萎病菌之后更加明顯。本研究表明,施用生物有機(jī)肥加生防菌處理可以顯著提高香蕉植株根尖β-1,3-葡聚糖酶的活性,加生防菌劑的處理明顯高于對(duì)照處理,其中,以生物有機(jī)肥+混合木霉菌劑處理的香蕉植株根尖β-1,3-葡聚糖酶的活性最高,達(dá)81U。這可能是病原菌的侵染和生防菌的誘導(dǎo)作用所致,β-1,3-葡聚糖酶的活性提高,使根際土壤中病原菌數(shù)量下降,從而降低了香蕉植株感病的幾率,這與何欣等的研究結(jié)果相似。土壤微生物功能多樣性和防病效果有一定的相關(guān)性,植物土傳病害的生物防治在一定程度上依賴于土壤微生物的群體作用,通過(guò)調(diào)控土壤微生物群落以及改變土壤微生物功能多樣性可以抑制土傳病害。當(dāng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富,物種越均勻,多樣性越高時(shí),對(duì)抗病原菌的綜合能力增強(qiáng)。其中,生防細(xì)菌含量可能是影響防病效果關(guān)鍵因素,它與土壤中真菌和病原菌尖孢鐮刀菌含量呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān),與防病效果呈極顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果表明,生物有機(jī)肥影響土壤中三大類微生物數(shù)量結(jié)構(gòu),與對(duì)照處理比較,土壤細(xì)菌和放線菌都得到顯著提高,真菌數(shù)量則有所下降,根際尖孢鐮刀菌的數(shù)量也大大減少。這可能是生防菌在有機(jī)肥協(xié)助下形成“基質(zhì)—菌群”生態(tài)系統(tǒng),更有利于調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境,生物有機(jī)肥中的有益菌和其它有益物質(zhì)一定程度上限制病原菌的生長(zhǎng),從而起到防病、抑病作用。土壤微生物生物量能反映參與調(diào)控土壤中能量和養(yǎng)分循環(huán)以及有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的對(duì)應(yīng)微生物數(shù)量,被認(rèn)為是土壤活性養(yǎng)分的儲(chǔ)庫(kù),是植物生長(zhǎng)可利用養(yǎng)分的重要來(lái)源。前人研究認(rèn)為施用有機(jī)肥料可以顯著地提高土壤微生物量碳、氮的含量,土壤有機(jī)質(zhì)與SMBC或SMBN有密切的正相關(guān)關(guān)系。本研究表明,通過(guò)施用生物有機(jī)肥,提高了土壤有機(jī)質(zhì)含量,為土壤微生物活動(dòng)提供優(yōu)良的生境,改善了土壤微生物群落組成,增加了微生物種群數(shù)量,以此抑制病原菌生長(zhǎng)。綜上所述,藥肥兩用生物有機(jī)肥能顯著降低香蕉枯萎病的發(fā)病率,提高防病效果。并能有效改善土壤微生物狀況,增加了土壤微生物種群數(shù)量,降低了病原菌數(shù)量,抑制香蕉枯萎病菌在土壤中的存活和繁殖,同時(shí)能提高相關(guān)防御性酶的活性,提高香蕉植株的抗病性。以生物有機(jī)肥為載體,加入生防菌劑,吸附量為10%(體積﹕質(zhì)量)。7-1混合木霉菌劑由3株拮抗木霉(T-40、T-58、T-109)按1:1:1的比例混合,含量達(dá)1×10cfu·mL以上;單株木霉菌劑T-40