高效提取物對(duì)樟子松枯梢病菌保護(hù)酶活性的影響

高效提取物對(duì)樟子松枯梢病菌保護(hù)酶活性的影響

樟子松是中國(guó)北方最重要的造林樹(shù)種，在生態(tài)和環(huán)境恢復(fù)方面發(fā)揮著重要作用。樟子松枯梢病是由松球殼菌Sphaeropsissapinea(Fr.)DykoetSutton引起的一種發(fā)病普遍、危害性大的世界性的傳染性病害。枯梢病屬于寄主主導(dǎo)性病害,對(duì)該類(lèi)病害的控制應(yīng)以提高寄主抗性及降低病原菌種群數(shù)量為主要方向。木霉菌Trichodermaspp.是自然界中資源豐富的拮抗微生物,具有抗菌譜廣、適應(yīng)性強(qiáng)和多機(jī)制性的特點(diǎn)。首先,木霉菌競(jìng)爭(zhēng)作用強(qiáng),木霉菌還能產(chǎn)生揮發(fā)性或非揮發(fā)性的抗菌類(lèi)物質(zhì),對(duì)多種病原菌有抑制作用。此外,它還具有重寄生作用,通過(guò)胞外酶破壞病原菌細(xì)胞壁,削弱病原菌的生長(zhǎng)勢(shì),甚至殺死病原菌,目前世界范圍內(nèi)已有以木霉為主要成分的生物殺菌劑,在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。同時(shí),很多木霉種類(lèi)對(duì)植物還具有促生抗逆的作用,通過(guò)定殖和次生代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物生長(zhǎng),提高植物抗病能力。篩選開(kāi)發(fā)有效控制樟子松枯梢病的木霉菌株及其制劑產(chǎn)品,對(duì)保持樟子松林微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定、有效控制枯梢病的發(fā)生、減少化學(xué)農(nóng)藥的使用具有重要意義。本研究利用篩選獲得的高效木霉菌株T-43制備不同劑型菌劑進(jìn)行了野外應(yīng)用研究,為進(jìn)一步研究木霉對(duì)松枯梢病菌的抑菌機(jī)理并開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的生物菌劑打下理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1森林微生物信息(1)木霉菌株:28株木霉。國(guó)外引進(jìn)7株,課題組在國(guó)內(nèi)分離21株。上述菌株保存于東北林業(yè)大學(xué)森林微生物研究中心,菌株具體信息見(jiàn)表2。(2)病原菌株:樟子松枯梢病菌—松球殼菌Sphaeropsissapinea(Fr.)DykoetSutton,自遼寧省防風(fēng)固沙研究所章古臺(tái)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)樟子松人工林內(nèi)感病樟子松上分離,保藏于東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林微生物研究中心。1.2測(cè)試方法1.2.1生長(zhǎng)和競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法。以單獨(dú)接種病原菌株和木霉菌株的平板作為對(duì)照,每處理3次重復(fù)。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每8h測(cè)量一次菌落半徑。計(jì)算各菌株生長(zhǎng)被抑制率、木霉菌株相對(duì)抑制效果、木霉菌株生長(zhǎng)速度,統(tǒng)計(jì)競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)。觀察是否有拮抗線產(chǎn)生,對(duì)峙培養(yǎng)中競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。被抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-對(duì)峙培養(yǎng)菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。相對(duì)抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率。1.2.2非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的制備和抑菌活性測(cè)定非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的制備:切取培養(yǎng)好的木霉菌餅3片接種到300mLPD培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)(25℃,150r/min)7d,過(guò)濾菌絲,取濾液分別與正己烷、乙酸乙酯和正丁醇按1:3體積比,靜置萃取2d后分液去除無(wú)機(jī)相,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)相。用濾液1/10體積的5%Tween80溶液溶解萃取物,同時(shí)將未萃取的發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原體積的1/10,備用。抑菌活性測(cè)定:采用菌絲生長(zhǎng)抑制法。將上述非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物添加到PDA培養(yǎng)基中,搖勻,使非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物終濃度達(dá)到20%。倒平板,接入病原菌,以不添加代謝產(chǎn)物的PDA平板培養(yǎng)作為對(duì)照,25℃恒溫培養(yǎng)5d。采用十字交叉法測(cè)量病原菌的菌落直徑,計(jì)算各木霉菌株非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制率,每處理3次重復(fù)。1.2.3保護(hù)酶活性的測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)是生物體中最重要的抗氧化酶,能夠催化生物氧化過(guò)程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基為O2和H2O2,保持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。過(guò)氧化氫酶(CAT)是一種以鐵卟啉為輔基的酶,能清除SOD的歧化產(chǎn)物H2O2為O2和H2O,避免某些具有生理功能的蛋白質(zhì)和巰基酶被氧化,喪失活性,對(duì)生物膜造成損傷。過(guò)氧化物酶(POD)是清除H2O2與許多有機(jī)氫過(guò)氧化物的抗氧化酶之一,它對(duì)H2O2非常專(zhuān)一。多酚氧化酶(PPO)也是植物重要的保護(hù)酶之一。本研究擬從提取物對(duì)病原菌保護(hù)酶系統(tǒng)中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性的影響角度,探討木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌機(jī)理。參考冀瑞卿、計(jì)紅芳的方法。將PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d的病原菌菌絲用無(wú)菌水洗凈后置于20mL含10%提取物的無(wú)菌水中,靜置。分別于2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h后取樣,測(cè)定菌絲保護(hù)酶活性,以10%吐溫80處理為空白對(duì)照。SOD、POD、CAT、PPO酶活測(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。1.2.4藥物、試劑和儀器(1)試驗(yàn)地概況:樟子松枯梢病野外防治基地設(shè)在遼寧省固沙所章古臺(tái)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的樟子松林內(nèi)。樟子松標(biāo)準(zhǔn)地建立于1985年,林齡25年,胸徑15cm,樹(shù)高15m,枯梢病發(fā)病率70%以上,適合進(jìn)行生物防治。(2)野外應(yīng)用時(shí)間:2010、2011年連續(xù)兩年進(jìn)行防治。2010年以濃度梯度篩選試驗(yàn)為主,2011年以對(duì)比試驗(yàn)為主。對(duì)樟子松枯梢病的防治采用病害控制方式,病害控制時(shí)間選擇在樹(shù)木發(fā)病后。(3)菌劑制備:根據(jù)高效菌株篩選結(jié)果,采用國(guó)內(nèi)菌株T-C14和引進(jìn)菌株T-43制備菌劑,進(jìn)行野外應(yīng)用研究。菌劑采用孢子粉劑和液體菌劑兩種。孢子粉劑的制作:將木霉孢子液加入菌糠培養(yǎng)基中,25℃恒溫培養(yǎng)7d后,用滅菌玻璃棒攪拌培養(yǎng)料,促進(jìn)產(chǎn)孢。3d后收獲培養(yǎng)料,風(fēng)干,過(guò)200目篩,制備孢子粉劑。其中菌株T-43孢子粉劑濃度為3.2×107g,菌株T-C14孢子粉劑濃度為1.7×107g,分裝后4℃保存?zhèn)溆谩Ｒ后w菌劑的制作:將木霉孢子液接種于300mLPD培養(yǎng)基中,25℃恒溫震蕩培養(yǎng)7d,過(guò)濾去除菌絲,將發(fā)酵液與乙酸乙酯按1:3的比例(V/V)進(jìn)行萃取,2d后分液去除無(wú)機(jī)相,將有機(jī)相進(jìn)行減壓濃縮,后用5%的Tween80溶解制備液體菌劑。(4)菌劑施用方法:2010濃度梯度試驗(yàn):設(shè)定不同濃度梯度菌劑進(jìn)行野外應(yīng)用研究。菌劑為孢子粉劑和液體菌劑。濃度設(shè)定見(jiàn)表4每個(gè)濃度梯度防治20株樹(shù),設(shè)3個(gè)重復(fù),設(shè)定空白對(duì)照。采用樹(shù)冠噴霧的方式施藥。用藥時(shí)間為2010年7月10日、7月20日和7月30日。2010年9月調(diào)查病情指數(shù),利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析,篩選最佳濃度梯度。2011對(duì)比試驗(yàn):以T-43為目標(biāo)菌株制備孢子粉劑和液體菌劑進(jìn)行野外應(yīng)用研究。同時(shí)選用商品化的木霉分生孢子可濕性粉劑作為對(duì)照,濃度設(shè)定見(jiàn)表5。每個(gè)處理20株樹(shù),設(shè)3個(gè)重復(fù)。菌劑施用時(shí)間為2011年7月10日、7月20日和7月30日。2011年9月調(diào)查病情指數(shù),利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析,評(píng)價(jià)防治效果。病害損失估計(jì)采用分級(jí)計(jì)數(shù)法,以病情指數(shù)表示發(fā)病程度,病情指數(shù)計(jì)算:病情指數(shù)=[Σ(病級(jí)株數(shù)×代表數(shù)值)/株數(shù)總和×最重一級(jí)代表數(shù)值]×100。防治效果=(對(duì)照區(qū)感病指數(shù)-防治區(qū)感病指數(shù))/對(duì)照區(qū)感病指數(shù)×100%。2結(jié)果與分析2.1病原菌生長(zhǎng)和誘導(dǎo)誘導(dǎo)生長(zhǎng)各木霉菌株對(duì)病原菌株均有不同程度的抑制效果(表2)。對(duì)峙培養(yǎng)48h后,菌株T-C14、T-C33、T-43、T-19和T-28對(duì)病原菌生長(zhǎng)抑制率均在50%左右,菌株生長(zhǎng)速度較快,競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)高,在同病原菌對(duì)峙培養(yǎng)中,能迅速占領(lǐng)生態(tài)位,最終覆蓋病原菌,病原菌在木霉菌株的拮抗下幾乎停止生長(zhǎng)。與木霉菌株接觸的病原菌株,其氣生菌絲開(kāi)始逐漸稀疏甚至萎蔫。菌株T-19、T-C33能越過(guò)病原菌生長(zhǎng)區(qū)域并逐漸將病原菌菌落覆蓋,菌株T-43、T-28和T-C14與病原菌之間形成明顯的拮抗線,并最終覆蓋病原菌。通過(guò)比較,引進(jìn)木霉菌株優(yōu)勢(shì)明顯,菌株T-28、T-43對(duì)病原菌的相對(duì)抑制效果達(dá)到6以上,在抑制病原菌生長(zhǎng)的同時(shí),自身的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有受到抑制,而是直接覆蓋病原菌,競(jìng)爭(zhēng)系數(shù)最高。2.2高效抑菌試驗(yàn)結(jié)果各菌株的各非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物及發(fā)酵原液對(duì)病原菌的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制效果(表3)。引進(jìn)菌株中T-43抑菌效果最好,其原液和乙酸乙酯提取物的抑菌率均超過(guò)90%;菌株T-28原液和菌株T-13原液的抑菌率分別超過(guò)81%和65%。病原菌在平板上菌絲稀疏,生長(zhǎng)明顯變?nèi)跎踔敛簧L(zhǎng),被完全抑制。國(guó)內(nèi)菌株中,T-C33抑菌效果最好,其原液和乙酸乙酯提取物的抑菌率均超過(guò)76%;其次為菌株T-C14,其原液和正丁醇提取物的抑菌率均超過(guò)63%。同正己烷相比,正丁醇和乙酸乙酯萃取效果更好,而真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí),乙酸乙酯沸點(diǎn)更低,同原液相比,萃取后的代謝產(chǎn)物抑菌活性更強(qiáng)。在進(jìn)一步的野外應(yīng)用中,以乙酸乙酯為萃取劑進(jìn)行大規(guī)?；钚猿煞值奶崛≈苽洹＞C合對(duì)峙培養(yǎng)和抑菌試驗(yàn)結(jié)果,選用引進(jìn)菌株T-43作為防治枯梢病生物菌劑的出發(fā)菌株,制備孢子粉劑和液體菌劑進(jìn)行野外應(yīng)用研究。以國(guó)內(nèi)高效菌株T-C14作為對(duì)照,對(duì)比國(guó)內(nèi)外菌株對(duì)樟子松枯梢病的生物防治能力,評(píng)價(jià)應(yīng)用效果。4種保護(hù)酶對(duì)木霉菌株T-43發(fā)酵液乙酸乙酯提取物均比較敏感,在整個(gè)測(cè)試過(guò)程,都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)(圖3~圖6),四種保護(hù)酶變化趨勢(shì)基本相同,對(duì)照組酶活基本處于緩慢2.4最佳劑量為3.4%、3.2細(xì)胞劑、3-10h率和4.3-羥基苯磺酸鈉t-4、5-特異分子10.連續(xù)兩年在樟子松枯梢病發(fā)病嚴(yán)重的遼寧省固沙所章古臺(tái)實(shí)驗(yàn)基地樟子松人工林進(jìn)行木霉菌劑野外應(yīng)用研究結(jié)果顯示,不同濃度梯度的菌劑的防治效果存在顯著差異,其中引進(jìn)菌株T43液體菌劑(10倍液)對(duì)樟子松枯梢病的控制效果超過(guò)94%,孢子粉劑(300倍液)控制效果超過(guò)上升的趨勢(shì),處理組酶活在10-12h達(dá)到峰值,后迅速下降,48h后酶活幾乎為零。上述結(jié)果說(shuō)明處理組菌體在提取物的逆境脅迫下,前期SOD、CAT、POD和PPO互相協(xié)調(diào)一致,呈現(xiàn)上升趨勢(shì),來(lái)發(fā)揮它們對(duì)菌體的保護(hù)作用,后期由于氧自由基的增加和膜脂過(guò)氧化的加重,細(xì)胞透性增加,蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重,最終導(dǎo)致各種酶含量的降低或消失,菌體死亡。68%。國(guó)內(nèi)菌株T-C14液體菌劑(10倍液)控制效果也超過(guò)78%,孢子粉劑(150倍液)控制效果超過(guò)63%,引進(jìn)菌株對(duì)樟子松枯梢病的控制能力明顯好于國(guó)內(nèi)的高效菌株(表4)。2011年在確定菌劑最佳應(yīng)用濃度的基礎(chǔ)上,選擇商品化木霉分子孢子可濕性粉劑作為對(duì)比。結(jié)果表明,T-43液體菌劑10倍液防治效果達(dá)到75%以上,分生孢子粉劑效果不理想,T-43分生孢子粉劑防治效果66.67%,對(duì)照(木霉分生孢子可濕性粉劑)防治效果72%,均低于T-43液體菌劑(表5)。3結(jié)論和討論3.1菌株的體外抗菌作用通過(guò)木霉菌株與病原菌株平板對(duì)峙培養(yǎng)研究、木霉菌株非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌活性研究,高效木霉菌株對(duì)病原菌保護(hù)酶活性的影響研究以及野外應(yīng)用研究,得出以下結(jié)論:(1)引進(jìn)菌株T-43和T-28對(duì)樟子松枯梢病菌具有顯著的拮抗作用。引進(jìn)菌株T-43發(fā)酵液原液和乙酸乙酯提取物對(duì)病原菌抑制效果顯著。(2)引進(jìn)菌株T-43乙酸乙酯提取物顯著降低病原菌保護(hù)酶(SOD、CAT、POD和PPO)活性,使病原菌氧自由基增加、膜脂過(guò)氧化的加重、細(xì)胞透性增加、蛋白質(zhì)變性嚴(yán)重,最終導(dǎo)致各種酶含量的降低或消失,菌體死亡。(3)菌株T-43液體菌劑10倍液對(duì)樟子松枯梢病具有顯著的控制效果。3.2菌株的生長(zhǎng)和抗菌作用樟子松在我國(guó)很多地區(qū)廣泛分布,具有抗旱、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn),為三北防護(hù)林工程和治沙工程建設(shè)的主要針葉造林樹(shù)種。枯梢病是一種世界上廣泛發(fā)生的病害,該病主要發(fā)生于苗木和中老齡樹(shù)木上。樟子松枯梢病屬于寄主主導(dǎo)性病害,是多種生態(tài)因素長(zhǎng)期協(xié)同作用的結(jié)果,屬于林木生態(tài)病害。單純的化學(xué)防治對(duì)該類(lèi)病害很難奏效,而且會(huì)帶來(lái)一系列環(huán)境問(wèn)題。基于微生態(tài)調(diào)控的生物防治技術(shù)是通過(guò)人為引進(jìn)高效拮抗菌株抑制病原菌,達(dá)到保持生態(tài)系統(tǒng)平衡,控制病害發(fā)生的目的。木霉菌作為普遍存在并具有豐富資源的拮抗微生物,在植病生防中具有重要的不可替代的地位。在土傳病害、葉部病害等的生物防治中發(fā)揮了重要的作用,并形成了多個(gè)商品化的品種,在生物農(nóng)藥中占據(jù)了重要的地位。木霉菌對(duì)病原菌的拮抗作用具有廣譜性的特點(diǎn)。但不同的種、同種的不同菌株都存在著拮抗活性的差異及拮抗對(duì)象種類(lèi)上的差別。本研究對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外的28個(gè)木霉菌株進(jìn)行了篩選。在對(duì)峙培養(yǎng)中,菌株T-43對(duì)樟子松枯梢病菌具有極強(qiáng)的拮抗和競(jìng)爭(zhēng)作用,對(duì)峙培養(yǎng)2d,對(duì)病原菌的抑制率達(dá)到60.17%,相對(duì)抑制效果為6.05,在抑制病原菌生長(zhǎng)的同時(shí),自身的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有受到抑制,而是直接覆蓋病原菌。筆者其它的試驗(yàn)結(jié)果證明,菌株T-43對(duì)主要林木病原菌包括:樟子松枯梢病菌Sphaeropsissapinea、楊樹(shù)爛皮病菌Cytosporachrysosperma、楊樹(shù)葉枯病菌Alternariaalternata、沙棘干縮病菌Fusariumsporotrichoides、苗木立枯病菌Rhizoctoniasolani、Fusariumoxysporum、Pythiumdebaryanum均有明顯的拮抗作用,說(shuō)明該菌是適應(yīng)性較強(qiáng)的廣譜性拮抗菌,在病害生物防治中具有廣闊的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。高克祥對(duì)楊樹(shù)潰瘍病的高效拮抗木霉進(jìn)行了篩選,其中哈茨木霉T-88和深綠木霉T-95對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌Cytosporachrysosperma和楊樹(shù)水泡潰瘍病菌Dothiorellagregaria的抑制率可以達(dá)到60%以上,與本文篩選的高效菌株相似。T-43同時(shí)具有重寄生作用,通過(guò)對(duì)峙菌落的顯微觀察,T-43對(duì)樟子松枯梢病菌具有明顯的重寄生作用,T-43產(chǎn)生附著胞或者鉤狀分枝吸附于病原菌的菌絲上,使病原菌菌絲斷裂死亡,該結(jié)果與Chet的觀察結(jié)果一致。研究證明,木霉菌的次生代謝產(chǎn)物豐富,可產(chǎn)生揮發(fā)或不揮發(fā)性的抗生素類(lèi)物質(zhì),如木霉菌素(trichodermin)、膠毒素(gliotoxin)、膠綠木霉素(glioviridin)、綠色菌素(viridin)和抗菌肽(antibioticpeptide)以及揮發(fā)性抗菌素等。該功能可以與其它的生防作用機(jī)制(競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用、胞壁降解酶等)發(fā)揮協(xié)同增效作用,達(dá)到抑制病原的目的,同時(shí)對(duì)植物具有促生