幾丁質(zhì)添加物對木霉生長的影響

幾丁質(zhì)添加物對木霉生長的影響

木霉是一種重要的預(yù)防和控制菌。有許多國際藥物已經(jīng)通過了木菌等有效藥物的注冊，主要用于植物土壤傳遞疾病的預(yù)防和控制。木霉菌制劑的研究,特別是以提高木霉菌制劑防治效果為目的的添加劑研究,對于木霉菌的商品化十分重要。木霉菌可以與多種農(nóng)用物質(zhì)同時使用,例如肥料等,營養(yǎng)物質(zhì)也影響木霉菌的存活與繁殖。Sivan等將溴甲烷與哈茨木霉菌結(jié)合使用,Hadar等在木霉菌等中加入麩皮,Mirzabaev則以海綠石(glauconite)作為木霉菌添加物,這些工作都證明適當?shù)奶砑游镔|(zhì)可以提高木霉菌對病害的防治效果。僅在土壤中接種木霉菌的分生孢子,木霉菌不能增殖;使用含有微量基礎(chǔ)培養(yǎng)基的菌體,厚垣孢子在土壤中可以增殖100倍。因此,添加輔助物質(zhì)幫助木霉菌在作用位點快速增殖,也能在一定程度上改善木霉菌的防治效果。本文研究了幾種化學(xué)殺菌劑對木霉菌生長的影響以及幾丁質(zhì)類添加劑對木霉菌防治棉花病害效果的影響。1材料和方法1.1哈茨木霉菌t.harvianum綠色木霉菌(Trichodermaviride)LTR-2和LR,哈茨木霉菌(T.harzianum)Q1和Q2;對照菌為粉紅粘帚霉(Gliocladiumroseum)GLR(由加拿大阿爾伯特大學(xué)植物病理系J.P.Tewari教授提供)。1.2可濕性粉劑所有待測化學(xué)殺菌劑都按照有關(guān)標準進行有效含量標定。主要涉及的有50%多菌靈可濕性粉劑,江蘇省無錫農(nóng)藥廠生產(chǎn);50%苯菌靈可濕性粉劑,江蘇安邦集團生產(chǎn);70%甲基硫菌靈可濕性粉劑,日本曹達株式會社生產(chǎn)。1.3影響木霉菌生長的因素采用濾紙片法測定了10種化學(xué)殺菌劑對棉花枯萎病菌的殺菌作用,在此基礎(chǔ)上,篩選出多菌靈,苯菌靈和甲基硫菌靈3種殺菌劑,確定它們對木霉菌生長的影響程度。將50%多菌靈可濕性粉劑,50%苯菌靈可濕性粉劑和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑分別用蒸餾水配制成2%懸浮液,取不同量分別加入PDA培養(yǎng)基中,制成含不同濃度殺菌劑的PDA平板,接種直徑為0.6cm的含木霉菌瓊脂塊于平板中央,另設(shè)不含殺菌劑的對照平板,設(shè)置3次重復(fù),置于28℃溫箱培養(yǎng),3d后,對照菌落長滿平板,測量所有菌落直徑,作為抑菌能力指標。1.4一些丁物質(zhì)對木霉防劑的影響1.4.1將naoh溶液加入受氧干或在hcl液中制備取蝦蟹殼在105℃下烘干,加入過量的0.1mol/L的NaOH,煮沸至半透明,更換一次NaOH溶液,繼續(xù)煮沸30min,用自來水洗滌至中性,加入過量的0.1mol/L的HCl,煮沸30min后冷卻,放置過夜,更換1次HCl溶液,繼續(xù)放置過夜,然后用自來水洗滌至中性,于105℃下烘干,粉碎至100目,備用。1.4.2菌種的活化培養(yǎng)將小麥籽粒在水中浸泡2d,吸足水分,分裝于玻璃瓶中,用8層紗布封口,保持良好的透氣性,121℃濕熱滅菌30min,冷卻后接種木霉菌和粉紅粘帚霉GLR,置于28℃下培養(yǎng),培養(yǎng)過程中每隔一定時間用滅菌的玻璃棒充分攪拌,待其大量產(chǎn)孢后取出,常溫下風(fēng)干,粉碎為250目的粉狀,加到5%可溶性淀粉水溶液中,使菌劑分生孢子的含量為2×109/g。1.4.3木霉菌分生孢子的制備將棉種(魯棉12號)用55℃水處理20min,隨之25℃浸種24h。除去多余水分,30℃催芽12h,取露白種子用菌劑處理后播種。將生防菌劑與催芽后的種子混合,使木霉菌的分生孢子為107個孢子/粒,常溫下風(fēng)干至無明顯水跡后播種,每盆播種12粒,每處理3盆,設(shè)3個重復(fù)。處理分別是LTR-2,LTR-2+C(C代表幾丁質(zhì),下同),LR,LR+C,GLR,GLR+C,Q1,Q1+C和多菌靈(按種子重量1%拌入)。設(shè)2個對照:清水和5%可溶性淀粉包衣。幾丁質(zhì)先加在分生孢子懸浮液中,然后包在棉花種子上,幾丁質(zhì)的用量為每100g棉花種子1g。播種后覆蓋2cm滅菌土。1.4.4田間菌種防治試驗取棉花田中的自然土壤混入草炭土(比例2∶1),121℃濕熱滅菌30min,然后拌入病原菌?？菸【名溋Ｉ芭囵B(yǎng)基,黃萎病菌用棉籽培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)。枯萎病菌按土壤重量(干重)的2.5%接種,黃萎病菌按土壤重量的3%接種,充分拌勻,裝入花盆,吸水達持水量70%～80%時播種。棉花立枯病防治試驗在上茬種植棉花的病圃中進行,田間接菌時取表層土拌入棉花立枯病菌(麥粒砂培養(yǎng)基培養(yǎng)),然后將高含菌量的菌土均勻撒于田中,使最終田中表層3cm土壤的接菌量約為1%,每處理1.5m2,隨機排列,重復(fù)3次,于棉花生長至出現(xiàn)真葉時調(diào)查立枯病的發(fā)病情況。棉花枯、黃萎病分別于4～5片真葉時剖桿調(diào)查。病害調(diào)查標準、方法以及防治效果計算見參考文獻。2結(jié)果2.1對3種藥物的敏感性從表1可以看出木霉菌對3種殺菌劑高度敏感,所有測定菌株在2.68μg/ml時完全不生長,特別指出的是Q1、Q2對3種殺菌劑極敏感,1.66μg/ml時生長即已完全被抑制。這種結(jié)果意味著將野生型木霉菌直接同上述殺菌劑復(fù)合使用是不合適的。2.2不同大小真菌體之間的比較從試驗結(jié)果看(表2),Q1,LTR-2,LR+C,GLR+C和GLR處理對棉花立枯病的防效較好,最高的是Q1,但是同多菌靈、LR+C、LTR-2、GLR、GLR+C之間沒有明顯的差異。從總體情況看,Q1,LTR-2,LR+C和GLR+C的防效是較好的,均優(yōu)于多菌靈處理。幾丁質(zhì)對生物防治菌防治棉花立枯病效果的影響是不一樣的,只有LR加入幾丁質(zhì)后防治效果得到提高,Q1和LTR-2加入幾丁質(zhì)以后防治效果反而喪失,有待于探討。2.3木霉菌和糯米粉粘墻霉菌對棉花枯渙病的防效從表3和表4可見,菌劑處理對棉花枯萎病和黃萎病的防效是明顯的,用發(fā)病率及病指所計算的防效基本一致。與多菌靈處理相比較,木霉菌和粉紅粘帚霉菌對棉花枯萎病的防效接近多菌靈的防效,有的處理(如LTR-2+C)的防效甚至高于多菌靈?？梢钥闯鰩锥≠|(zhì)使木霉菌對棉花枯萎病的防治效果得到了明顯的提高(表3);而對于棉花黃萎病的防治效果,除了Q1之外,其余菌株的防治效果加入幾丁質(zhì)后都有不同程度的下降(表4)。3關(guān)于木霉菌的消毒研究植物病害生物防治菌的最終目的是使它們成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有用的制劑。制劑的成功與否取決于生物防治菌是否能夠商品化生產(chǎn)及其市場競爭力。制劑研究有兩個重要方面,一是提高生物防治菌的防治效果,二是延長生物防治菌劑的貨架期。這兩個方面除了依靠菌株改良外,添加劑或者助劑的使用也是不可忽視的重要手段,適當?shù)闹鷦┎坏軌蛱岣叻乐涡Ч?延長制劑貨架期,還有可能降低生產(chǎn)成本,賦予制劑更多的功能。本文研究了化學(xué)殺菌劑對木霉菌的抑菌能力,甲霜靈、速克靈在5000μg/ml時對木霉菌LTR-2等沒有明顯的抑菌作用,而多菌靈、苯菌靈和甲基硫菌靈在很低濃度時即可殺傷木霉菌,其它幾種殺菌劑如代森鋅、菌核凈等的殺菌效力介于兩個極端之間。雖然多菌靈對木霉菌殺傷作用很大,但是我們的研究工作顯示,低濃度的多菌靈(10μg/ml)可以提高木霉菌在土壤中的存活量。菌株LTR-2對蔬菜灰霉病有良好的防治效果,其制劑已經(jīng)在中華人民共和國農(nóng)業(yè)部臨時登記注冊,它對速克靈等灰霉病防治用藥不敏感,可以與該類殺菌劑混用。可見在適當?shù)那闆r下,某些殺菌劑是可以與木霉菌混合使用的。幾丁質(zhì)添加物對木霉菌(包括粉紅粘帚霉菌)的防治效果有一定影響。試驗了Q1,LTR-2,LR和GLR等菌株在幾丁質(zhì)存在時防治棉花病害的效果。在立枯病防治試驗中,同不加幾丁質(zhì)的處理相比,LR加入幾丁質(zhì)后防治效果明顯提高,從無效菌株變?yōu)橛行Ь?GLR加幾丁質(zhì)處理的發(fā)病率與單獨使用GLR相似,而其余菌株加入幾丁質(zhì)后的發(fā)病率反而增高,幾丁質(zhì)可以為LTR-2,GLR和Q1所利用,并誘導(dǎo)它們產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶,而幾丁質(zhì)酶則有利于生防菌對病原菌的寄生和水解,因而理論上應(yīng)有提高效果的作用,但本試驗有些結(jié)果則與此相反,在棉花黃萎病防效試驗中也得到了類似的