消痞顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性萎縮性胃炎胃黏膜bcl-2和bax表達(dá)的影響

消痞顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性萎縮性胃炎胃黏膜bcl-2和bax表達(dá)的影響

慢性萎縮性胃炎（cag）由于不典型的增生（pd）而發(fā)病率很高，但對(duì)其治療沒有影響。除了對(duì)其進(jìn)行密切的護(hù)理和手術(shù)外，現(xiàn)代醫(yī)療之外，沒有其他方法可以更好地治療神經(jīng)退行性胃炎。臨床實(shí)踐表明,中醫(yī)中藥治療取得較為滿意的效果,顯示了其廣闊的發(fā)展前景。在成功建立CAG伴ATP動(dòng)物病理模型的基礎(chǔ)上,已有研究觀察了中藥消痞顆粒劑對(duì)CAG伴ATP大鼠胃黏膜組織形態(tài)、生化及銀染核仁形成區(qū)(silver-stainingnucleolarorganizerregion,AgNOR),癌胚抗原(carcino-embryonicantigen,CEA)及ras癌基因表達(dá)產(chǎn)物rasP21的影響,筆者進(jìn)一步探討其對(duì)大鼠胃黏膜Bax和Bcl-2表達(dá)的影響,從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步探討CAG伴ATP發(fā)生機(jī)制及中藥防治的有效機(jī)制,為臨床用藥提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1大鼠分組及模型建立雄性Wistar大鼠60只,體重260～280g,由維通利華公司提供,隨機(jī)將大鼠分為5組:正常組,病理模型組,自然恢復(fù)組,消痞顆粒劑治療組,陽性對(duì)照(維酶素)組,每組12只。1.2開腹彈簧內(nèi)固定參照文獻(xiàn)方法,大鼠禁食不禁水24h后,以3.5%水合氯醛1ml/100g腹腔麻醉。在無菌條件下開腹,在腺胃距胃幽門環(huán)0.2cm處切小口,將一長約2cm的金屬彈簧一端插入幽門環(huán),并用縫線將彈簧兩端固定。按手術(shù)常規(guī)逐層縫合胃及腹壁切口。手術(shù)1周后,每周給每只大鼠分別灌胃2次高鹽熱淀粉糊(60～70℃,含10%氯化鈉),每次2ml,至實(shí)驗(yàn)第16周結(jié)束,將模型組動(dòng)物處死,取材固定。1.3維酶素混懸液組消嗪顆粒消痞顆粒劑12g/袋,主要由黨參、炙百合、烏藥香櫞皮、丹參、三七粉、莪術(shù)、蒲公英、白花蛇舌草等藥組成,由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院制劑室制成沖劑。維酶素由北京長城制藥廠生產(chǎn),其主要成分為多種維生素、氨基酸及微量元素。消痞顆粒組給予消痞顆粒劑0.5ml/(100g·d)(濃度為0.6g/ml)灌胃,自然恢復(fù)組給予蒸餾水0.5ml/(100g·d)灌胃,陽性對(duì)照組給予維酶素混懸液0.5ml/(100g·d)(濃度為0.04g/ml)灌胃。以上各組均于造模完成后開始灌胃,每周6d,共12周,至實(shí)驗(yàn)第28周結(jié)束。1.4樣品采集和樣品處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取大鼠胃組織固定于10%甲醛中,常規(guī)取材,石蠟包埋,連續(xù)切片,切片厚4～5μm。1.5mmunstab和dab兔抗Bax多抗、兔抗Bcl-2多抗,免疫組化試劑盒(ImmunostainSPKit)為美國SantaCruz公司產(chǎn)品;DAB為美國Sigma公司產(chǎn)品;抗Bax多抗、抗Bcl-2多抗?jié)舛染鶠?∶300,以TBS稀釋。1.6疫組織化學(xué)法檢測(cè)bax和bcl-2染色常規(guī)蘇木精-伊紅染色,鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物(streptavidinperoxidaseConjugateSP)免疫組織化學(xué)法分別進(jìn)行Bax和Bcl-2染色。染色步驟:切片脫蠟至水,3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶,磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌,微波修復(fù),PBS洗滌3次,加入非免疫的羊血清封閉非特異性抗原,傾去血清,加入一抗,4℃孵育過夜,PBS洗滌,加入生物素標(biāo)記的二抗孵育,PBS洗滌,加入過氧化物酶-鏈酶卵白素孵育,PBS洗滌,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯透明、中性樹膠封片。1.7陽性染色細(xì)胞比例檢測(cè)1.7.1Bcl-2Bcl-2蛋白陽性反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色,主要位于腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),偶可伴核著色,以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)均勻一致的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。每張切片在高倍鏡下觀測(cè)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,依據(jù)鏡下陽性染色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的比例判定染色結(jié)果,采用半定量積分法,即根據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞比例及著色深淺計(jì)分,著色細(xì)胞比例<1/3為1分,1/3～2/3為2分,>2/3為3分;著色程度:無著色為0分,淺藍(lán)色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分,兩者合計(jì)統(tǒng)計(jì)積分。1.7.2BaxBax蛋白陽性反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色,主要位于腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),偶可伴核著色,以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)均勻一致的棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。先在低倍鏡(×4)下確定這些區(qū)域,再于200倍(20×10,0.739mm2/視野)下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù),并求其均數(shù)。1.8統(tǒng)計(jì)處理方法運(yùn)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用ANOVA方差分析、方差齊性檢驗(yàn)并進(jìn)行多重比較。2結(jié)果2.1集體龍眼觀察模型組胃竇黏膜局灶蒼白區(qū),粟粒狀結(jié)節(jié)較為多見;消痞顆粒組仍可見局灶蒼白區(qū),粟粒結(jié)節(jié)減少;自然恢復(fù)組和維酶素組與模型組相比變化不大。2.2消嗪顆粒對(duì)胃黏膜形態(tài)的影響正常組胃黏膜厚度正常,上皮細(xì)胞及腺體排列整齊,大小形狀較一致,細(xì)胞呈單層柱狀,胞質(zhì)透明或呈小空泡狀,腺上皮與腺管分界清楚;固有腺及黏膜層毛細(xì)血管無擴(kuò)張瘀血,黏膜肌層較薄。模型組胃黏膜萎縮變薄,腺體數(shù)量減少,間質(zhì)內(nèi)有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,可見淋巴濾泡形成和腸上皮化生(IM)以及不同程度的ATP,表現(xiàn)為細(xì)胞大小、形態(tài)不一,核漿比例增大,極向紊亂,核分裂明顯個(gè)別腺體呈共壁形象或囊性擴(kuò)張。消痞顆粒組胃黏膜上皮排列規(guī)整,腺體大小、形態(tài)較一致,無明顯變性、壞死;黏膜層仍有少量炎細(xì)胞浸潤,表現(xiàn)為輕度淺表性胃炎或接近正常胃黏膜。維酶素組存在程度不等的慢性淺表性、萎縮性胃炎等改變,較模型組輕。2.3不同處理對(duì)bcl-2表達(dá)的影響B(tài)cl-2陽性反應(yīng)細(xì)胞呈棕黃色,定位在胞質(zhì),細(xì)胞核有少量表達(dá),在正常大鼠黏膜增殖帶有表達(dá),模型組、自然恢復(fù)組ATP處表達(dá)顯著增強(qiáng),與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,ATP的程度越重,Bcl-2陽性表達(dá)越明顯。經(jīng)消痞顆粒治療后Bcl-2陽性表達(dá)減弱,接近正常組,維酶素組與自然恢復(fù)組和模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1,表1。2.4各組bax陽性表達(dá)比較Bax染色陽性信號(hào)為棕褐色顆粒,陽性部位主要在胞質(zhì)、胞核有少量表達(dá)。正常組黏膜增殖帶有明顯表達(dá);模型組、自然恢復(fù)組ATP處表達(dá)減少,隨ATP的程度加重,Bax陽性表達(dá)明顯減少;消痞顆粒組Bax陽性表達(dá)增加。結(jié)果表明模型組Bax陽性表達(dá)較正常組減少;消痞顆粒組及維酶素組Bax陽性表達(dá)增加,但與模型組、自然恢復(fù)組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2,表2。3消手術(shù)治療胃黏膜促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用胃黏膜上皮組織更新較快,以細(xì)胞凋亡和增殖維持著細(xì)胞總數(shù)的平衡,倘若這一平衡被打破就有可能導(dǎo)致許多疾病發(fā)生,高速增殖的細(xì)胞基因易損傷且無法正常修復(fù),為胃癌的發(fā)生提供了條件,腫瘤的發(fā)生不僅是細(xì)胞增殖異常性疾病同時(shí)也是細(xì)胞凋亡異常性疾病,Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡的作用,在人類罹患的各類癌癥中,超過半數(shù)表達(dá)高水平的Bcl-2蛋白,Bax對(duì)抗Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡的作用,Bcl-2/Bax兩蛋白之間的比例是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素。Bcl-2蛋白作為一種凋亡抑制基因起延長細(xì)胞壽命的作用,單獨(dú)Bcl-2的表達(dá)增多不足以引發(fā)腫瘤狀態(tài),Bcl-2可以與某些癌基因和病毒產(chǎn)物產(chǎn)生協(xié)同作用。目前已發(fā)現(xiàn)了一組與Bcl-2序列有同源性的基因稱Bcl-2基因家族,它們的顯著特征是其表達(dá)調(diào)控細(xì)胞凋亡。該家族可分為功能相拮抗的2組。家族成員通過競(jìng)爭(zhēng)調(diào)控細(xì)胞死亡。Bax是編碼Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2associatedXprotein,Bax)的基因,Bax是極重要的促細(xì)胞凋亡基因,Bax蛋白與Bcl-2蛋白有21%的同源性,具有對(duì)抗Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡的作用。胃腸道正常腺體基底部細(xì)胞有Bcl-2表達(dá),Bcl-2在整個(gè)胃腸道包括結(jié)腸、小腸和胃的腺體分化不良病變中表達(dá)增加,且其周邊上皮也有表達(dá)異常,也有研究認(rèn)為Bcl-2在良性病變到惡性病變的發(fā)展過程中,隨ATP程度的加重而遞增,一旦癌變,細(xì)胞的陽性表達(dá)又降低,可能Bcl-2參與胃癌的啟動(dòng)和胃癌形成的早期。Bcl-2和Bax兩者間的比例關(guān)系影響細(xì)胞凋亡狀態(tài),Bcl-2表達(dá)水平較高時(shí),可形成Bcl-2和Bcl-2同源二聚體,細(xì)胞凋亡受抑制;Bax表達(dá)水平較高時(shí),則形成Bax和Bax同源二聚體,加速細(xì)胞凋亡。研究顯示胃黏膜發(fā)生IM之前細(xì)胞凋亡指數(shù)和增殖指數(shù)均呈遞增趨勢(shì),細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖呈正相關(guān),凋亡與增殖比接近于1。IM、ATP、胃癌細(xì)胞凋亡指數(shù)漸降低,而細(xì)胞增殖則仍呈遞增趨勢(shì),細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān),凋亡與增殖比<1。由淺表性胃炎、胃癌前病變、胃癌演變過程中,Bcl-2蛋白表達(dá)陽性率逐漸增加,Bax蛋白表達(dá)陽性則逐漸減少,Bcl-2/Bax逐漸增加,該點(diǎn)與細(xì)胞增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)變化基本一致。筆者研究顯示正常大鼠胃竇部黏膜的增殖帶部分細(xì)胞可檢出Bcl-2蛋白,而CAG伴有ATP的黏膜則出現(xiàn)了Bcl-2蛋白表達(dá)的顯著增強(qiáng),與文獻(xiàn)報(bào)道的人類胃癌前病變時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)的變化規(guī)律一致。消痞顆粒治療后,大鼠胃黏膜的Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著下降。正常大鼠胃竇部黏膜的增殖帶有Bax蛋白表達(dá),而模型組Bax陽性表達(dá)的顯著減弱,經(jīng)消痞顆粒治療Bax表達(dá)有一定增強(qiáng),但結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與樣本量較少有關(guān),消痞顆粒治療后胃黏膜病變病理形態(tài)明顯改善,提示其可能通過抑制Bcl-2表達(dá),上調(diào)Bax表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡而起作用,同時(shí)可能還存在其他方面的機(jī)制。消痞顆粒根據(jù)該病病機(jī)以本虛標(biāo)實(shí),虛實(shí)夾雜為特點(diǎn),選藥組方考慮到胃喜降惡升、喜通惡滯、喜涼潤惡溫燥的生理特性,以益氣養(yǎng)陰、理氣散結(jié)、活血化瘀、清熱解毒為法,以百合烏藥湯化裁而成。方中黨參、炙百合補(bǔ)氣養(yǎng)陰潤燥;烏藥、香櫞皮理氣消脹,可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,調(diào)整胃動(dòng)力;黨參、百合與烏藥、香櫞皮合用,扶正而不礙邪,驅(qū)邪而不傷正,補(bǔ)而不滯。方中所選用丹參、三七粉活血化瘀,現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為三七具有改善微循環(huán)、消炎作用;其成分三七總皂甙有明顯增加腸系膜血流量,有抗炎及一定的消除氧自由基作用,可能通過降低癌基因的異常表達(dá)發(fā)揮治療胃癌前病變的作用,丹參、三七,一寒一溫活血不傷正,與入氣分的烏藥、香櫞同用,氣血同調(diào),共奏