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不同培養(yǎng)基對馬鈴薯愈傷組織誘導和再生的影響

甘薯是屬于茄子科的一種茄子植物,起源于美國安第斯山脈。這是水稻、小麥和玉米的第四種主要食品和蔬菜,世界年產量為3億t。國際馬鈴薯中心(CIP)的研究表明,世界范圍內對馬鈴薯的需求量到2020年將有望增長20%,超過水稻、小麥、玉米的增長,屆時發(fā)展中國家對馬鈴薯的需求量將是2000年的2倍。由于馬鈴薯是無性繁殖作物,依靠薯塊維持品種的特性,并且正是這種特性導致病毒的積累,因此在培育脫毒馬鈴薯品種時首先要通過外植體的組培來繁殖脫毒苗。此外,一些珍貴的馬鈴薯品種在繼代培養(yǎng)時由于各種原因容易被污染,其中較輕微的污染也可以通過外植體組培來挽救。近幾年來,雖然中外研究人員在馬鈴薯離體培養(yǎng)及試管苗生根研究方面取得了一定的進展,但是初接種污染率高、外植體分化較難、離體培養(yǎng)物褐化退化現(xiàn)象嚴重、增殖系數(shù)低等問題一直未能得到很好的解決。本試驗以青海省主栽馬鈴薯品種的當年生帶腋芽莖段為材料,研究了從初培繼代增殖到生根各階段的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件,試圖建立一套較完整的馬鈴薯無菌培養(yǎng)體系,以期為青海省主栽馬鈴薯品種的組培工作提供參考。1材料和方法1.1材料的制備及保鮮外植體的采集工作在腋芽萌動到枝條停止生長期內均可以,采集時間一般以本地6月初到7月初為宜,取材不宜過晚,否則植株在大田中容易染病,不利于外植體消毒。本試驗中的外植體材料取自青海省農林科學院生物技術研究所的試驗田,供試品種為青薯2號、青薯9號、費烏瑞它。具體的取材時間在晴天中午,因為此時的枝條暴露在強烈陽光下,有利于殺菌。選取當年生半木質化的新梢,特別注意枝上應有飽滿的芽;去掉頂部的嫩枝及枝上的葉片,因為葉片一方面占據(jù)了很大空間,另一方面容易攜帶病菌。將枝條剪成3~4cm帶芽的莖段后,先用洗潔精水漂洗10min左右,再用自來水沖洗至洗潔精基本清除,然后泡在無菌水中備用。1.2ms誘導培養(yǎng)基的制備在超凈工作臺上,先將外植體用70%乙醇處理20s,然后分別用濃度為0.05%、0.075%、0.10%的氯化汞浸泡4、6、8min,并在小型搖床上搖晃,使得氯化汞與外植體充分接觸浸泡,最后用無菌水清洗4~5次并剪掉一小截莖段下部,以避免氯化汞滲入而影響營養(yǎng)吸收。試驗用基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。將處理好的外植體分別接種于MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)18d,觀察滅菌效果并統(tǒng)計,將成活的莖段轉接到6種添加了不同植物激素的MS誘導培養(yǎng)基上。誘導培養(yǎng)基的配方分別為:MS+3mg/L6-BA+0.01mg/LNAA;MS+4mg/L6-BA+0.01mg/LNAA;MS+2.25mg/L6-BA+0.2mg/LNAA;MS+1mg/L6-BA+1mg/LZT+0.5mg/LIAA;MS+1.75mg/LZT+1mg/LIAA;MS+2mg/LZT+1mg/LIAA。在光照強度2000lx、光照時間16h、培養(yǎng)溫度25℃的條件下培養(yǎng),將誘導產生的愈傷組織轉接到配方為MS+0.3mg/LGA3的分化培養(yǎng)基中,分別調查愈傷組織的產生情況與芽分化情況。1.3外植體導率的計算本研究中相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計的公式為:愈傷誘導率=產生愈傷的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;芽分化率=分化芽的愈傷塊數(shù)/總愈傷塊數(shù)×100%。2結果與分析2.1外植體不同莖段的滅菌效果,主要體現(xiàn)外植體無菌體系的建立對于整個試驗過程是非常重要的,將青海省主栽的3個基因型馬鈴薯外植體莖段進行9種處理。由表1、表2、表3可知,外植體青薯2號用70%乙醇處理30s、0.100%的氯化汞處理8min的滅菌效果最佳;外植體青薯9號莖段用70%乙醇處理30s、0.100%氯化汞處理5min的滅菌效果最佳;外植體費烏瑞它莖段用70%乙醇處理30s、0.125%氯化汞處理8min的滅菌效果最佳。其中青薯9號的滅菌效果最好,無菌率最高的達到了81.3%,0.100%氯化汞處理5min的褐化率為25.0%。在研究中發(fā)現(xiàn),有些莖段在處理時即使出現(xiàn)褐化死亡,卻仍然有真菌污染,說明在采樣時帶有真菌孢子,而氯化汞對真菌孢子的消毒效果不好。將消毒滅菌的馬鈴薯外植體接種到初培培養(yǎng)基上的結果表明,在莖段的腋芽處均能萌發(fā)出綠色不定芽,因而有足夠的材料用于繼代培養(yǎng),初培試驗比較成功。2.2培養(yǎng)基zt對誘導率的影響在6種培養(yǎng)基中誘導3種基因型馬鈴薯的愈傷組織,表4結果表明:青薯9號的平均愈傷誘導率最高,達到94.05%;其次為費烏瑞它。表明如果用作轉基因操作中的轉化受體,青薯9號的效果最佳。從培養(yǎng)基對誘導率的影響看,MS+3mg/L6-BA+0.01mg/LNAA、MS+1.75mg/LZT+1mg/LIAA、MS+2mg/LZT+1mg/LIAA對青薯2號、青薯9號的效果較好;MS+4mg/L6-BA+0.01mg/LNAA、MS+2mg/LZT+1mg/LIAA對費烏瑞它的效果較好;MS+2.25mg/L6-BA+0.2mg/LNAA的總體效果一般。2.3化率大小的測定由表4、表5的結果可以看出:與愈傷組織誘導率的順序一致,芽分化率大小表現(xiàn)為青薯9號最高,平均為28.22%;其后依次為費烏瑞它、青薯2號,與青薯9號的差異分別達到5.69、11.33百分點,說明不同基因型的馬鈴薯作為受體時需要選擇轉化率高的。3不同基因型對馬鈴薯外植體植株分化的影響馬鈴薯的初代培養(yǎng)是組織培養(yǎng)中最關鍵的一步。馬鈴薯枝條長期暴露在田間,容易孳生各種各樣的細菌,有的細菌甚至能長入組織內部,因此外植體即使經過細致的表面滅菌,仍然會發(fā)生污染。此外,馬鈴薯富含酚類物質,因此克服污染和褐化這兩大難題是馬鈴薯初代培養(yǎng)成功的關鍵。在整個消毒滅菌過程中,HgCl2的滅菌濃度和時間是最重要的,不同的基因型要選擇最佳的處理組合。植物激素種類和基因型對馬鈴薯外植體植株的再生有一定的影響,從試驗結果可以看出:不同基因型外植體的平均分化率差距很大,變化范圍為16.89%~28.22%,這說明在選擇轉化受體時應該考慮高再生率的基因型。同一基因型的外植體在不同的激素作用下分化率也有差別,配方為MS+1mg/L6-BA+1mg/LZT+0.5mg/LIAA的培養(yǎng)基分

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