遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)八 植物基因組DNA提取

實(shí)驗(yàn)八植物基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)九、DNA的PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物回收實(shí)驗(yàn)十、DNA與載體的連接和轉(zhuǎn)化是基因工程中最基本的操作技術(shù)基因工程狹義：人工創(chuàng)造DNA分子新組合的技術(shù)（即重組DNA技術(shù)）廣義：重組DNA技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)和應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大部分。上游技術(shù)是指重組DNA技術(shù)；下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或基因工程細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化，動(dòng)、植物轉(zhuǎn)基因等DNA重組微生物發(fā)酵分離、提純產(chǎn)品生物反應(yīng)器狹義轉(zhuǎn)基因廣義+提取DNA（8）篩選文庫(kù)/PCR（9）連接（10)載體細(xì)胞DNA載體重組載體宿主擴(kuò)增（基因）酶切基因基因轉(zhuǎn)化(10)+上游技術(shù)下游基因修飾動(dòng)物（假想圖）基因修飾植物（假想圖）小規(guī)模發(fā)酵大規(guī)模發(fā)酵下游技術(shù)實(shí)驗(yàn)八、植物基因組DNA提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵参锘蚪MDNA提取的原理掌握植物基因組DNA提取的方法掌握DNA瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)掌握用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度的方法1.獲取細(xì)胞：研磨、勻漿……2.裂解細(xì)胞：凍融、SDS……3.分離DNA：

CTAB、苯酚……4.純化DNA

乙醇、RNA酶……二、實(shí)驗(yàn)原理真核細(xì)胞的核基因組存在于細(xì)胞核內(nèi)，所以提取真核基因組DNA需要先破碎細(xì)胞膜和核膜，然后分離和純化DNA。提取過程中要防止酸、堿和DNA酶對(duì)DNA的降解1.獲取細(xì)胞動(dòng)物植物微生物或培養(yǎng)細(xì)胞液氮研缽取少量組織，速凍+離心上清(棄)沉淀(留)研磨細(xì)胞2.裂解細(xì)胞凍融能破壞細(xì)胞膜，SDS(十二烷基磺酸鈉)能破壞核膜并抑制DNA酶的活性3.分離DNA

CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)與核酸形成不溶于低鹽溶液(0.3mol/LNaCl)的復(fù)合物，通過離心可除去蛋白和多糖，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物溶解于高鹽溶液中(0.7mol/LNaCl)，加入乙醇使核酸沉淀，離心除去溶于乙醇中的CTAB4.純化DNA用酚氯仿抽提除去殘留蛋白質(zhì)；用70%乙醇對(duì)核酸沉淀進(jìn)行洗滌以除去溶于70%乙醇的NaCl等雜質(zhì)；加入RNA酶以除去RNA1.材料

菠菜Spinaciaoleracea2n=122.試劑Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒。（生工公司）三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑取50-100mg組織，液氮充分研磨，并轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。600ul65℃預(yù)熱的BufferPCB12ulβ-巰基乙醇65℃水浴,25-30分鐘（間或混勻）12000rpm離心5min，吸取上清至新的1.5ml離心管

（450ul)加入等體積的氯仿加入等體積的BufferBD,混勻加入等體積的無水乙醇轉(zhuǎn)移至吸附柱，靜止2min10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液加入500ulPWSolution加入500ulWashSolution10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2min取出吸附柱，放入1個(gè)新的1.5ml離心管中（干燥）加入30ulTE靜止3min12000rpm離心2min取5μl電泳檢測(cè)取2μl紫外檢測(cè)-4℃或-

20℃保存標(biāo)記4-1-姓名（450ul)（450ul)3次先做組織剪碎

-20℃凍結(jié)40min,用槍頭在離心管底部按壓10次左右電泳檢測(cè)23130bp9416bp6557bp4361bp2322bp2027bpλ-HindⅢdigest(1％Agarose)

取2μlDNA溶液，加滅菌水稀釋至80μl，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光值

當(dāng)A260/A280≈1.8左右時(shí)，提示DNA質(zhì)量良好

當(dāng)A260/A280>2.0時(shí)，提示含有較多RNA

當(dāng)A260/A280<1.6時(shí)，提示含有較多蛋白質(zhì)濃度為1μg/μl的天然雙鏈DNA在260nm波長(zhǎng)處的吸光值為0.020，所以：

DNA濃度(μg/μl)=A260×50×稀釋倍數(shù)

紫外檢測(cè)五、注意事項(xiàng)1對(duì)DNA做好標(biāo)記，-20℃保存

2使用離心機(jī)時(shí)必須先配平3電泳凝膠中所加的溴化乙錠(EB)有致癌性，GoldView

雖無致癌性，但其溶液酸性較強(qiáng)，但對(duì)皮膚和眼睛有