松材線(xiàn)蟲(chóng)遺傳多樣性的遺傳分析

松材線(xiàn)蟲(chóng)遺傳多樣性的遺傳分析

封閉式動(dòng)物的個(gè)體差異小，均勻，具有相同的基因型和遺傳特征，因此是熒光試驗(yàn)的材料。近幾十年來(lái),隨著國(guó)內(nèi)外線(xiàn)蟲(chóng)學(xué)研究的迅速發(fā)展,為適應(yīng)不同課題研究需要,自由生活型線(xiàn)蟲(chóng)、昆蟲(chóng)原線(xiàn)蟲(chóng)、動(dòng)物寄生及植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)均有近交系線(xiàn)蟲(chóng)培育的報(bào)道(Dropkinetal.,1986;Gaugleretal.,1991;Sternbergetal.,2003;Baietal.,2005;Grantetal.,2006;Dolginetal.,2007)。松材線(xiàn)蟲(chóng)(Bursaphelenchusxylophilus)是松樹(shù)萎蔫病的病原,雖然為植物寄生線(xiàn)蟲(chóng),卻易于在實(shí)驗(yàn)室條件下用植物愈傷組織或真菌進(jìn)行培養(yǎng)(Iwahorietal.,1990)。經(jīng)典生物學(xué)的研究已基本闡明了松材線(xiàn)蟲(chóng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生活史、傳播媒介、寄生范圍等問(wèn)題,然而,到目前為止,松材線(xiàn)蟲(chóng)病的致病機(jī)制尚未研究清楚,人們對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)致病的分子機(jī)制知之甚少。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,使得從分子水平上研究松材線(xiàn)蟲(chóng)病成為可能。已有研究表明:松材線(xiàn)蟲(chóng)群間及種群內(nèi)存在高度的遺傳多樣性(成飛雪,2005;陳蔚詩(shī),2006),為此,建立遺傳一致的純合種群用于松材線(xiàn)蟲(chóng)生物學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)等研究具有重要意義。松材線(xiàn)蟲(chóng)的生殖方式為雌雄異體生殖,其繁殖可通過(guò)控制交配進(jìn)行遺傳操縱,基因位點(diǎn)近乎純合的近交系可通過(guò)進(jìn)行多次嚴(yán)格近交獲得。本文報(bào)道了松材線(xiàn)蟲(chóng)近交系的構(gòu)建過(guò)程。1材料和方法1.1公民道德松樹(shù)ba試驗(yàn)用松材線(xiàn)蟲(chóng)為強(qiáng)毒蟲(chóng)株AMA3,該蟲(chóng)株由黃任娥(2007)于2004年10月分離自安徽省馬鞍山市林場(chǎng)白馬山病死松樹(shù),使用前培養(yǎng)于灰葡萄孢(Botrytiscinerea)上,4℃保存。1.2不同蔗糖的滅菌配制1/10倍馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(1/10×PDA)(馬鈴薯20g,蔗糖2g,瓊脂粉15g,水1000mL),于121℃下滅菌30min,倒平板。將灰葡萄孢接種至上述1/10×PDA培養(yǎng)基中,25℃下培養(yǎng),獲得稀疏的灰葡萄孢培養(yǎng)基。1.3卵粒及系統(tǒng)發(fā)育首先將產(chǎn)卵雌蟲(chóng)吸入凹玻片的自來(lái)水水滴中產(chǎn)卵30min,將雌蟲(chóng)從玻片上洗去,獲得新產(chǎn)下的卵。添加清水至凹玻片中,于25℃條件下,在萊卡顯微鏡下每隔30min觀察卵的胚胎發(fā)育,直至孵化,獲得胚胎發(fā)育時(shí)間;進(jìn)而將大量線(xiàn)蟲(chóng)置于培養(yǎng)皿中,產(chǎn)卵30min,獲得大量卵,卵孵化獲得大量同步2齡線(xiàn)蟲(chóng),將2齡幼蟲(chóng)接種至長(zhǎng)滿(mǎn)稀疏灰葡萄孢菌絲的1/10×PDA上,每小皿接30~40條,25℃下培養(yǎng)。前3天每隔12h分離線(xiàn)蟲(chóng),第4天每隔3h分離線(xiàn)蟲(chóng),在顯微鏡下觀察線(xiàn)蟲(chóng)的發(fā)育,直至成蟲(chóng)出現(xiàn)。1.4灰葡萄孢近交系的獲得、分離、培養(yǎng)將松材線(xiàn)蟲(chóng)從灰葡萄孢中分離出來(lái),用0.1%硫酸鏈霉素進(jìn)行表面消毒(非嚴(yán)格無(wú)菌),用自制毛細(xì)管在顯微鏡下挑取性別分化明顯的L4雌、雄幼蟲(chóng),成對(duì)轉(zhuǎn)移至用1/10×PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢菌塊中。灰葡萄孢菌塊大小為5mm×5mm左右,置于直徑2.5~3.0cm的小培養(yǎng)皿中。25℃下保濕培養(yǎng)。根據(jù)前述生活史觀察結(jié)果,于接種4~5天后,在小培養(yǎng)皿中加入清水,并將培養(yǎng)基切成更小的小塊,使線(xiàn)蟲(chóng)從稀疏的灰葡萄孢中游出,在體視顯微鏡下檢查交配情況:如果各培養(yǎng)皿中均未發(fā)現(xiàn)子代,則該近交系滅絕;如果交配成功,但是除親本外,出現(xiàn)第3條成蟲(chóng),則放棄該對(duì)組合;如果交配成功,且近交后代中無(wú)成蟲(chóng)出現(xiàn),則從中成對(duì)挑取4齡(或3齡)線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至灰葡萄孢菌塊中。為了確保近交系順利進(jìn)行,每一世代盡可能多地挑取幼蟲(chóng)進(jìn)入下一世代,剩余幼蟲(chóng)及親本轉(zhuǎn)入新鮮灰葡萄孢中自由繁殖,作為每一世代的母本保存。每一對(duì)親本的后代挑完后,更換一支新的毛細(xì)管,以確保每一世代均為全同胞兄妹交配;所有承載來(lái)自同一對(duì)親本線(xiàn)蟲(chóng)的小培養(yǎng)皿放在直徑15cm的大培養(yǎng)皿中,以避免混亂。如此重復(fù)至20個(gè)世代,獲得線(xiàn)蟲(chóng)近交系。最后,收獲保留下來(lái)的近交系線(xiàn)蟲(chóng),接種于長(zhǎng)滿(mǎn)灰葡萄孢的PDA培養(yǎng)基上,待其將葡萄孢吃盡后,再轉(zhuǎn)接于玉米粒培養(yǎng)的灰葡萄孢中生長(zhǎng),保存于4℃冷庫(kù)中。試驗(yàn)過(guò)程中詳細(xì)記錄近交譜系。本試驗(yàn)中,近交系名稱(chēng)采用字母及數(shù)字表示,字母代表原始種群的來(lái)源及父母本代號(hào),數(shù)字反映近交代數(shù)。具體做法是在成對(duì)挑取線(xiàn)蟲(chóng)時(shí),給予每對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)1個(gè)編號(hào),然后每增加1個(gè)世代增加1個(gè)數(shù)字。1.5培養(yǎng)指標(biāo)及接種量從冷庫(kù)中將松材線(xiàn)蟲(chóng)AMA3原始種群及C、D和E近交系的第6,10,15和20代近交種群取出,在長(zhǎng)滿(mǎn)灰葡萄孢的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),10天后用貝爾曼漏斗法分離線(xiàn)蟲(chóng),采用皮接法對(duì)2年生健康黑松(Pinusthunbergii)進(jìn)行人工接種,接種量為每株2000條,每種處理接種6株,以清水為對(duì)照。接種后24h內(nèi)給脫脂棉滴加適量蒸餾水保濕。室內(nèi)溫度保持25~30℃,逐日觀察松苗發(fā)病情況。1.6數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。2結(jié)果與分析2.1不同發(fā)育期松材線(xiàn)蟲(chóng)成蟲(chóng)的孵化為了能夠在近交系建立過(guò)程中準(zhǔn)確掌握每個(gè)世代分離子代幼蟲(chóng)的時(shí)間,首先對(duì)松材線(xiàn)蟲(chóng)AMA3蟲(chóng)株的各個(gè)發(fā)育階段進(jìn)行了研究,以掌握該蟲(chóng)株的完成1個(gè)世代所需時(shí)間,即生活史。試驗(yàn)結(jié)果表明:在25℃條件下,松材線(xiàn)蟲(chóng)從單細(xì)胞卵到2齡幼蟲(chóng)(L2)孵化最早為19h,25h后大約有60%的卵孵化。在灰葡萄孢上,2齡幼蟲(chóng)大約持續(xù)1天后蛻皮成為3齡幼蟲(chóng)(L3),3齡幼蟲(chóng)大約持續(xù)1天后蛻皮成為4齡幼蟲(chóng)(L4)。L4發(fā)育時(shí)間較長(zhǎng),L2接種至灰葡萄孢培養(yǎng)基75h后,約有10%的成蟲(chóng)出現(xiàn),4%L4正在蛻皮;96h后,成蟲(chóng)占23.7%,6.6%L4正在蛻皮。成蟲(chóng)形成后,1天之內(nèi)開(kāi)始交配、產(chǎn)卵。因此,AMA3的生活史大約為4~5天。2.2信號(hào)近交繁殖將松材線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)成對(duì)轉(zhuǎn)移至灰葡萄孢塊中,于25℃下培養(yǎng),4~5天后鏡檢結(jié)果表明:單對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)交配主要出現(xiàn)以下幾種情況:1)雌、雄蟲(chóng)及其子代;2)只見(jiàn)雌蟲(chóng)及其子代;3)只見(jiàn)雄蟲(chóng)及其子代;4)雌、雄蟲(chóng)均在但無(wú)子代;5)僅見(jiàn)雌蟲(chóng)或僅見(jiàn)雄蟲(chóng);6)見(jiàn)到2條雄蟲(chóng)或2條雌蟲(chóng)。最理想的為第1種情況,在將其子代成對(duì)挑取進(jìn)行近交后,雌、雄蟲(chóng)及剩余子代被轉(zhuǎn)入新鮮灰葡萄孢中培養(yǎng)任其自由繁殖,作為每一世代的母本保存。第2,3種情況可繼續(xù)挑子代進(jìn)行近交。如果近交成功率非常低,第4,5,6種情況下的雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)亦可重新利用,即將第4種情況下的雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至新鮮灰葡萄孢中繼續(xù)培養(yǎng),第5和第6種情況下的雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)進(jìn)行重新組合。起初,近交繁殖是在AMA3、ZF4及GZ13個(gè)松材線(xiàn)蟲(chóng)原始線(xiàn)蟲(chóng)種群分別設(shè)幾條線(xiàn)進(jìn)行,但是由于工作量太大,所以放棄了ZF4及GZ1。以下僅統(tǒng)計(jì)起源于AMA3種群的單對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)交配情況。首先,從AMA3原種群中挑30對(duì)L4雌雄線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行單對(duì)交配,4天后,在小培養(yǎng)皿中加入清水,鏡檢結(jié)果表明,7對(duì)獲得成功(成功率為23.3%)。選取其中5對(duì)子代線(xiàn)蟲(chóng)較多的開(kāi)始近交繁殖,分別稱(chēng)A、B、C、D和E系,其中,A系和B系分別在近交第5代和第3代后滅絕。C系、D系和E系單對(duì)交配成功率分別為24.6%(536/2182)、21.4%(257/1201)和24.5%(406/1657),與原始種群?jiǎn)螌?duì)交配成功率相近。C系各世代線(xiàn)蟲(chóng)單對(duì)交配成功率差異不明顯;D系和E系單對(duì)交配成功率分別于第7代和第9代出現(xiàn)顯著下降后上升并一直保持穩(wěn)定(表1)。第19次近交中,共有109對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)成功交配,產(chǎn)生第20代線(xiàn)蟲(chóng)(C系72對(duì),D系19對(duì),E系18對(duì))(表1),挑取了其中80對(duì)的子代至新鮮灰葡萄中擴(kuò)大繁殖,最終獲得近交系80個(gè),其余交配對(duì)中因子代數(shù)量較少或已出現(xiàn)世代重疊而被舍棄。2.3變異蟲(chóng)體發(fā)現(xiàn)松材線(xiàn)蟲(chóng)近交過(guò)程中較少發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體畸形現(xiàn)象,僅在近交18代后發(fā)現(xiàn)6條變異蟲(chóng)體,其中C系和D系分別3條。蟲(chóng)體變異多為雌蟲(chóng)(5/6),主要是體態(tài)變得粗短肥胖或者體表有很多疣突,變異雌蟲(chóng)與正常形態(tài)雄蟲(chóng)交配后,其子代均恢復(fù)正常。2.4代近交種群線(xiàn)蟲(chóng)的致凋亡和致病性對(duì)2年生黑松進(jìn)行接種試驗(yàn),結(jié)果表明來(lái)自3對(duì)親本的第6,10,15和20代近交種群線(xiàn)蟲(chóng)均能使黑松發(fā)病,有些種群的致萎率與原始種群相當(dāng),有些種群的致萎率強(qiáng)于原始種群其中,其中接種C系F20的植株于接種后第8天最先發(fā)病,發(fā)病率于28天后最早達(dá)100%,表明近交系線(xiàn)蟲(chóng)依然保持其強(qiáng)致病性。3ama3的建立本研究采用連續(xù)全同胞兄妹交配的方式建立了松材線(xiàn)蟲(chóng)強(qiáng)毒蟲(chóng)株AMA3的近交系。由于線(xiàn)蟲(chóng)種類(lèi)繁多,其生殖方式、生活方式各有不同。因此,近交系培育的方法也不一樣。對(duì)于行孤雌生殖的線(xiàn)蟲(chóng)如花生根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)(Meloidogynehapla),可通過(guò)連續(xù)每個(gè)世代轉(zhuǎn)移卵塊的方式進(jìn)行近交系的構(gòu)建(Liuetal.,2006)。雌雄同體線(xiàn)蟲(chóng),如異小桿線(xiàn)蟲(chóng)(Heterorhabditisbacteriophora)近交系的構(gòu)建可通過(guò)每世代挑取一條雌雄同體的成蟲(chóng)至含有共生菌的培養(yǎng)皿中,每一世代均確保自體交配(Gaugleretal.,1991;Baietal.,2005)。兩性生殖線(xiàn)蟲(chóng)的近交系構(gòu)建相對(duì)復(fù)雜,Dolgin等(2007)通過(guò)每世代嚴(yán)格挑取4齡雌雄幼蟲(chóng)交配的方式建立了C.remanei的近交系。有些專(zhuān)性寄生線(xiàn)蟲(chóng)的近交系構(gòu)建較為困難,如大豆孢囊線(xiàn)蟲(chóng)(Heteroderaglycines)、捻轉(zhuǎn)血矛線(xiàn)蟲(chóng)(Haemonchuscontortus)近交系的建立(Dropkinetal.,1986;Roosetal.,2004)。松材線(xiàn)蟲(chóng)雖為松樹(shù)寄生線(xiàn)蟲(chóng),但可實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),其生殖方式為雌雄異體兩性生殖,因此其近交系的構(gòu)建相對(duì)簡(jiǎn)單。為了確保每一世代均為全同胞兄妹交配,本試驗(yàn)采取通過(guò)每世代挑取一對(duì)4齡雌雄幼蟲(chóng)(或3齡幼蟲(chóng))交配的方式進(jìn)行近交系建立,而非每世代轉(zhuǎn)移一條懷孕雌蟲(chóng)的方式;為了確保各近交系不出現(xiàn)斷代,每一代均盡可能多地保持交配對(duì)數(shù)。本試驗(yàn)以AMA3強(qiáng)毒蟲(chóng)株為原始種群,最終建立了來(lái)自C、D和E3對(duì)親本的近交系,獲得近交系80個(gè)。其中,C、D和E系分別挑取了2182、1201和1657對(duì)線(xiàn)蟲(chóng),其單對(duì)交配成功率分別為24.6%、21.4%和24.5%。C系各世代線(xiàn)蟲(chóng)單對(duì)交配成功率差異不明顯;D系和E系單對(duì)交配成功率分別于第7代和第9代出現(xiàn)顯著下降后上升并一直保持穩(wěn)定。通常情況下,正常異交繁殖的動(dòng)植物進(jìn)行近親交配時(shí),可致使后代受隱性、有害的特性影響,使其繁殖力、適應(yīng)力降低,即近交衰退現(xiàn)象。Grant等(2006)發(fā)現(xiàn),哺乳動(dòng)物寄生線(xiàn)蟲(chóng)Parastrongyloidestrichosuri近交至5~8代時(shí),75%~80%的近交系滅絕。Dolgin等(2007)的研究表明,近交衰退使雌雄異體的C.remanei90%的近交系滅絕,但對(duì)雌雄同體的C.elegans則出現(xiàn)遠(yuǎn)交衰退。本試驗(yàn)中,第7代和第9代出現(xiàn)交配成功率顯著下降是否為近交衰退,不得而知。以感病黑松為宿主對(duì)AMA3原始種群及不同近交種群的致病力進(jìn)行的測(cè)定結(jié)果表明,來(lái)自3對(duì)親本的F6、F10、F15及F20松材線(xiàn)蟲(chóng)種群依然保持較強(qiáng)致病力,甚至有些種群的致萎率強(qiáng)于原始種群。當(dāng)然,由于接種的黑松數(shù)量