父系遺傳背景對(duì)小鼠超排效果及其孤雌胚胎體外發(fā)育的影響

父系遺傳背景對(duì)小鼠超排效果及其孤雌胚胎體外發(fā)育的影響

影響母乳喂養(yǎng)的因素很多，包括卵母細(xì)胞的質(zhì)量（ntess）。小鼠因?yàn)檫z傳背景清楚、來(lái)源方便經(jīng)濟(jì)、飼養(yǎng)條件容易控制等優(yōu)點(diǎn)而成為動(dòng)物克隆和ntESCs研究領(lǐng)域的重要試驗(yàn)動(dòng)物模型。小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量受到許多因素的影響,遺傳品系即是一個(gè)不可忽視的重要因素,因此研究小鼠遺傳品系對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響,對(duì)動(dòng)物克隆和建立ntESCs具有重要的理論意義?？寺?dòng)物的誕生以及胚胎干細(xì)胞(Embryonicstemcells,ESCs)所展現(xiàn)的巨大應(yīng)用潛力,引發(fā)了克隆性治療(Cloningtherapy)的研究熱潮?？寺⌒灾委煹哪繕?biāo)是通過(guò)體細(xì)胞核移植(Somaticnucleartransfer)獲得ESCs(ntESCs),雖然目前建立ntESCs的報(bào)道很多,但ntESCs分離建系效率仍然很低。自Wakayama等用B6D2F1卵母細(xì)胞作為卵胞質(zhì)受體,首次克隆出體細(xì)胞核移植小鼠以來(lái),這種遺傳背景的小鼠卵母細(xì)胞已常用于克隆小鼠和建立ntESCs的研究,而其他品系的小鼠使用很少,其原因可能和遺傳背景有關(guān)。但這種遺傳優(yōu)勢(shì)來(lái)源于父本還是母本,目前尚未見有關(guān)的研究報(bào)道。本研究以不同近交系雄鼠與遠(yuǎn)交系昆明母鼠的雜交F1代小鼠為研究對(duì)象,以KM自交系為對(duì)照,比較了3種不同遺傳背景的雜交小鼠與對(duì)照(KM自交系小鼠)的超排效果和孤雌胚胎體的體外激活率及其囊胚率,探討這3種父系遺傳背景對(duì)小鼠超排效果及卵母細(xì)胞孤雌胚胎體外發(fā)育的影響,以期為同類研究提供理論參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1李相運(yùn)博士捐贈(zèng)會(huì)6周齡以上成年昆明(KM)系雌鼠,質(zhì)量25~28g,購(gòu)自西安第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;6周齡以上成年129/Sv、C57BL/6J和C3H3種品系的雄鼠,質(zhì)量25~28g,由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)李相運(yùn)博士饋贈(zèng)。試驗(yàn)組小鼠由129/Sv、C57BL/6J、C3H3種公鼠分別與KM系母鼠交配獲得,即129/Sv×KM、C57BL/6J×KM、C3H×KM的F1代小鼠,對(duì)照組小鼠為KM×KM的F1代小鼠,均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院國(guó)家干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心自繁自養(yǎng)。小鼠在人工控溫(22~24℃)和人工光照(7:00~20:00光照;20:00~7:00黑暗)條件下進(jìn)行飼養(yǎng),自由飲水、采食。小鼠飼料購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.1.2促性腺激素試劑培養(yǎng)液KSOM和體外操作液FHM均購(gòu)自Chemicon公司,孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)購(gòu)自寧波第二激素制品有限公司,其他試劑均購(gòu)自Sigma公司。1.2方法1.2.1小鼠紅外受精神血工酶hcgfhm于18:00選擇體重28~30g、發(fā)情前期的小鼠(不同遺傳背景的小鼠每次2只),腹腔注射PMSG(6U/只),間隔48h后腹腔注射hCG(6U/只)。hCG注射后17h,頸部脫臼處死小鼠,手術(shù)取輸卵管置于FHM操作液中,體視顯微鏡下用玻璃針刺破膨大部,釋放卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)。將COC在含1g/L透明質(zhì)酸酶的FHM中作用3~5min,脫去顆粒細(xì)胞,用FHM洗3~4次,選擇折光效果好、并且排除第一極體的卵置于KSOM培養(yǎng)液中,在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng),以備用于統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞和可用卵母細(xì)胞的數(shù)量。1.2.2-dmap對(duì)ksom的激活作用將卵母細(xì)胞用含2.5μg/mL離子酶素的FHM處理5min(室溫條件下),FHM洗3~4次,再用含2.5mmol/L6-DMAP的KSOM在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)4h,KSOM洗3~4次,最后用KSOM培養(yǎng)液在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。24h后觀察卵裂情況,以卵裂作為卵母細(xì)胞激活的標(biāo)志。第4天觀察并記錄囊胚發(fā)育情況。1.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析用χ2檢驗(yàn)差異顯著性,P<0.05為差異顯著。2結(jié)果與分析2.1父系遺傳背景對(duì)fps小鼠超排效果的影響由表1可見,129/Sv×KM、C3H×KM、C57BL/6J×KM組與KM×KM組間的排卵數(shù)量和可用卵數(shù)量差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明129/Sv、C3H和C57BL/6J的父系遺傳背景對(duì)F1代小鼠的超排效果沒有影響。2.2小鼠卵母細(xì)胞激活率和囊胚發(fā)育率由表2可知,卵母細(xì)胞激活后48h,129/Sv×KM、C3H×KM、C57BL/6J×KM組與KM×KM組小鼠卵母細(xì)胞的激活率沒有顯著差異(P>0.05);129/Sv×KM組和C3H×KM組的囊胚發(fā)育率顯著高于C57BL/6J×KM組和對(duì)照組(P<0.05),C57BL/6J×KM組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明129/Sv和C3H父系遺傳背景不影響F1代孤雌胚胎的激活率,但對(duì)其囊胚發(fā)育率有一定影響。3父系和外交系小鼠超排、體外發(fā)育的影響本試驗(yàn)結(jié)果顯示,129/Sv×KM、C3H×KM、C57BL/6J×KM組和對(duì)照組的排卵數(shù)及可用卵母細(xì)胞數(shù)之間沒有顯著差異(P>0.05);試驗(yàn)組之間及試驗(yàn)組與對(duì)照組之間激活率差異不顯著(P>0.05);129/Sv×KM組和C3H×KM組父系遺傳背景小鼠的囊胚發(fā)育率顯著高于C57BL/6J×KM組和對(duì)照組(P<0.05),C57BL/6J×KM與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。超數(shù)排卵是外源激素參與排卵的過(guò)程,其效果不同程度地受小鼠品系、周齡、體重、激素劑量與處理程序的影響。不同品系小鼠超排效果的差異很大,有研究表明,遠(yuǎn)交系超排卵效果較近交系好,近交系之間雜交鼠的超排卵效果較近交系純系小鼠好。但是這種差別來(lái)源于父系還是母系,至今尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,129/Sv、C3H和C57BL/6J父系遺傳背景對(duì)F1代小鼠超排效果沒有影響,提示上述超排效果的差異可能來(lái)自于母本。小鼠胚源性基因的表達(dá)是在Ⅱ細(xì)胞期,第一次卵裂主要由母源基因控制。Goddard等研究表明,母源遺傳的發(fā)育信息在控制胚胎早期卵裂中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果還表明,3種近交系小鼠的父系遺傳背景不影響F1代孤雌胚胎的激活率,同時(shí)也表明本研究所用的激活方法對(duì)卵母細(xì)胞的激活率沒有影響。有研究發(fā)現(xiàn),遺傳背景影響體外受精胚胎的體外發(fā)育和胚胎干細(xì)胞的建系,如Orly等對(duì)129/Sv、C57BL/6J體外授精胚胎發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn),129/Sv的胚胎發(fā)育率顯著高于C57BL/6J。李相運(yùn)等研究發(fā)現(xiàn),129/Sv胚胎干細(xì)胞的建系率,高于遠(yuǎn)交系小鼠KM和CD-1及近交系小鼠C57BL/6J。但關(guān)于小鼠不同遺傳背景對(duì)孤雌胚胎體外發(fā)育影響的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),129/Sv×KM、C3H×KM的卵母細(xì)胞可促進(jìn)孤雌胚胎的體外發(fā)育。129/Sv×KM卵母細(xì)胞的這種特性可能與129/Sv小鼠具有高頻自發(fā)畸胎瘤的遺傳背景有關(guān);C3H雖沒有高頻自發(fā)畸胎瘤的遺傳背景,但是具有自發(fā)乳腺癌的遺傳背景,因此,C3H×KM的這種特性可能與C3H具有自發(fā)乳腺癌的遺傳背景有關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn),有些遺傳背景的小鼠并不能提高胚胎的體內(nèi)外發(fā)育能力。如Renard等研究發(fā)現(xiàn),C57BL/6J×DDK的胚胎只有部分能發(fā)育到囊胚,顯著低于DDK×DDK。本研究發(fā)現(xiàn),C57BL/6J×KM也不能顯著提高孤雌胚胎的體外發(fā)育能力,其原因還有待進(jìn)一步研究。選擇優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞,對(duì)提高克隆動(dòng)物及建立ntESCs系的成功率具有重要意義。遺傳背景是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的一