.7.23濤哥答疑錄(私聊版)

MJ:問題描述：首先是鋪墊+個人理解樣品墊中離子強度的問題，tirs和氫氧化鈉造成堿性原因是不同的，tirs吸收水中的氫離子，使水電離產生氫氧根離子，而氫氧化鈉直接電離出氫氧根離子，使溶液呈現(xiàn)堿性，所以個人認為如果單單是tris體系的緩沖液的話，溶液雖然呈堿性，但是離子強度較低，至少比相同摩爾濃度和酸堿度下，PB緩沖液的離子強度低很多。而您也說過，樣品墊要保持適當?shù)碾x子強度，來應對離子強度比較高的樣本。個人覺得離子強度過高的話，會影響抗原抗體的結合，這個可能沒有什么理論依據(jù)，只是個人覺得。問題1：如果要提高樣品墊中離子強度（我目前比較偏好TB體系，因為離子強度小，個人有離子強度影響結合的直覺），是加入PB體系，并且提高濃度，還是說不加PB，轉而加氯化鈉？問題2：目前在做全血樣品墊，大概的思路是：緩沖對+表面活性劑+抗RBC，篩選抗RBC的種類，切換濃度，看最適合的抗RBC的種類和量，這樣的做法的話就要求緩沖對+表面活性劑這個母液種類最好相對定，不然組別太多了，目前打算用100mMTris+40mMPB+1%Brij-35嘗試，想問下這樣的思路有沒有問題，或者有沒有能改進的地方，要不您直接推薦個緩沖對+表面活性劑的配方？大概就是這樣，應該夠具體了吧，請解答下吧T:你的直覺很對首先，樣品墊中離子強度的問題，tirs和氫氧化鈉造成堿性原因是不同的，tirs吸收水中的氫離子，使水電離產生氫氧根離子，而氫氧化鈉直接電離出氫氧根離子，使溶液呈現(xiàn)堿性，所以個人認為如果單單是tris體系的緩沖液的話，溶液雖然呈堿性，但是離子強度較低，至少比相同摩爾濃度和酸堿度下，PB緩沖液的離子強度低很多。你這段說的很對。TRIS相對于BBSPBSCBS這些確實離子強度低一些個人覺得離子強度過高的話，會影響抗原抗體的結合，這個可能沒有什么理論依據(jù)，只是個人覺得。這個說的也對。首先呢，我們先對樣品墊處理液的緩沖系統(tǒng)定下一個原則，要明白，樣品墊處理液中，我們?yōu)槭裁匆尤刖彌_系統(tǒng)。加入緩沖系統(tǒng)的目的主要是糾正個體樣本間PH的差異，也就是看重其緩沖能力。那么，緩沖系統(tǒng)在什么條件下緩沖能力比較強呢？任何一種緩沖系統(tǒng)都有一個最佳的緩沖范圍，比如TRIS-HCL體系最佳的緩沖范圍是8.0附近，大概是7.5-8.5之間。你在調整PH的時候，應該會有感覺：一開始加鹽酸的時候PH降的很快，到8.5左右的時候PH就降的很慢了，低于7.5的時候又下降很快了，在8.0左右的時候是最慢的需要加很多鹽酸，PH才會發(fā)生明顯變化。而PB呢，其最佳緩沖范圍在中性略偏堿性附近，也就是7.2左右。而硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液呢、最佳緩沖范圍大概在9.0左右。所以，我們該如何選擇緩沖系統(tǒng)呢？原則就有了：首先，我們會選擇一個緩沖范圍相對廣泛的緩沖體系，然后調整各種PH，觀察每個PH條件下的性能。比如，我們發(fā)現(xiàn)樣品墊PH在9.0左右效果最好，那么，我們可以直接選擇硼酸鹽緩沖液。如果我們發(fā)現(xiàn)，樣品墊PH在8.2左右效果最好，那就選擇TRIS。如果發(fā)現(xiàn)樣品墊處理液PH在7.0左右效果最好，那就選擇PB。不過，這里面有個問題，如果你一開始用0.01M的TRIS，會發(fā)現(xiàn)各個PH條件下性能變化不明顯。因為，這個濃度下TRIS的緩沖能力比較弱，也就是說一個緩沖體系的緩沖能力，不光跟PH有關，跟其使用濃度也有關。所以，最開始探索的時候，建議用0.1M的tris這樣結果差異會更明顯。你剛才說到一點，離子強度會影響抗原抗體的反應，這點很重要，抗原抗體的免疫反應主要就是那幾個作用力，而電荷對這些作用力的干擾是很明顯的，這種干擾不光體現(xiàn)在電荷的正負而且體現(xiàn)在數(shù)量上，所以合適的離子強度是很重要的，抗原抗體的反應有一個最佳的離子強度范圍，這個需要探索，當我們選擇一種緩沖系統(tǒng)之后一般PH會首先確定下來，接下來要對緩沖系統(tǒng)的濃度進行篩選。比如我們選擇了0.05M的Tris，此時，性能能夠達到最佳狀態(tài)，然后我們在這個緩沖系統(tǒng)基礎上，添加其它物質，用于進一步改善產品的性能。如果在性能評估和工藝調試過程中發(fā)現(xiàn)體系的抗干擾能力偏弱，比如你做早孕的項目，不同個體尿液的離子強度差異很大，有的會造成假陽性，這個時候你就需要考慮增強體系的抗干擾能力，如何屏蔽個體樣本離子強度的差異，這個我之前應該給你講過，通過高鹽的加入，可以達到這個目的，這個時候再加入氯化鈉。也就是說氯化鈉不是工藝體系所必需的組分，是根據(jù)需要而加入的，起輔助功能。有時候單純靠提高緩沖系統(tǒng)的濃度并不能完全解決問題，一味提高可能會出現(xiàn)副作用，這個時候就該考慮換個思路，加氯化鈉配伍一下，幾種物質的配伍往往能夠解決矛盾的問題，你想想看，整個體系是一個整體，牽一發(fā)而動全身，如果我們加入氯化鈉之后體系的抗干擾能力增強了，但是靈敏度變弱了，咋辦呢？需要通過其它的方式再去增強，也就是說我們一邊降低靈敏度，一邊又升高靈敏度，表面看來是做了無用功，實際上，我們提高了整個體系的抗干擾能力，基于不同的方法，對產品靈敏度的條件，都是為了解決特定的矛盾的問題。第二個問題首先你的思路是對的就是，先用最基本的工藝，來確定RBC的用量，不過，你這個母液不太合適。你為毛打算用兩種緩沖系統(tǒng)呢？你加兩種緩沖系統(tǒng)有點不倫不類，另外可能會互相影響緩沖范圍和緩沖能力。另外Brij35并不是最常用的一種表面活性劑，其主要是為了增加特異性，建議用常規(guī)的非溶血性表面活性劑，當然你用Brij35也沒錯，只是我個人不習慣而已。MJ：手頭有t20、t80、曲拉通100、s9、birj35哪個好？T：S9吧，S17也行，S17我那有。另外，檢測血液的，表面活性劑沒必要這么高濃度，一般0.5%-0.75%比較好。MJ：為毛不需要那么高？T：你用非溶血性的表面活性劑，往往都是固態(tài)的，比如S9，量多了容易粘稠，反而不利于層析。第三個問題，我可以先跟你說說，其實，鼠抗、兔抗、本身都不是問題，不存在哪個更好，而在于哪個更合適。紅細胞表面有很多抗原表位，其中一些表位是重復的，也就是多價的。這些重復的表位在參與免疫反應的時候很容易導致凝集反應，因此如果你用了一個單抗，這個單抗呢針對的紅細胞抗原表位是最豐富的，而且這個單抗的親和力很強，那么客觀上來說這個單抗導致紅細胞凝集的效率就會很高，此時，多抗就顯得有點遜色了。因為多抗是有眾多單抗組成的，其中一部分單抗，其實根本發(fā)揮不了作用，因為，他們針對的抗原表位太單一，不能形成明顯的凝集反應。MJ：萬一多抗里80%的抗體都只能結合一個紅細胞，剩下的20%去形成網(wǎng)狀結構的話，那豈不是很糾結？T：當然，一般不會這樣的哈，因為，免疫過程是有選擇性的，也就是說，機體往往對免疫原上面免疫能力強的表位產生很強的應答。也就是說，一般來講，多抗里面大部分還是針對紅細胞的多價表位的。如果這個單抗親和力偏弱呢，就不好說怎么樣了，如果這個單抗針對的抗原表位太單一呢，就沒啥用了。當然，這樣的單抗供應商是不會出售的，但是單抗的親和力畢竟存在差異，所以不同廠家提供的單抗性能就存在差異，有的廠家的單抗比多抗效果好有的則相反，因此單純說單抗好，還是多抗好沒有意義。多抗的好處就是：雖然我考不了100分，但是我一般不會低于80分。另外還有一點，也是選擇的原則之一，就是對質控線的影響，如果你某個產品采用了間接質控，比如說你HIV的項目你不想做直接質控，而做一個間接質控比如你標記一個兔IgG，然后C線用羊抗兔，那么如果你RB選擇了兔多抗，就有問題了。游離兔抗體太多了，會導致C線不顯色。再比如，你肌鈣蛋白I的項目標記的是鼠單抗，C線用的羊抗鼠，那么如果RBC是鼠單抗，對C線的顯色也會產生影響。還有一點，關于阻斷劑，阻斷劑從本質上來講也是一種鼠源抗體，阻斷劑的用量還不至于對質控線形成致命的影響。如果你的RBC是鼠源抗體，阻斷劑也是鼠源抗體，客觀上如果是HAMA陽性樣本，你的鼠抗紅細胞抗體會跟HAMA反應的，如果說好事呢，也算好事，起碼RBC抗體協(xié)助了阻斷劑來消滅HAMA，這個屬于援助，但是，消滅HAMA，不是RBC抗體的任務，他這屬于幫別人完成了任務，他自己的任務呢？兵力分散了，效果肯定要受到影響啊。比如，你這個HAMA陽性樣本是一個全血樣本，30%的RBC抗體去結合HAMA了，剩下70%的去凝集紅細胞，效果就大打折扣了。我說這個的意思并不是是用鼠源RBC抗體就一定會產生消極的影響，而是說你在進行RBC的篩選和用量控制的時候一定要考慮到這些問題，另外就算你用的兔源RBC抗體也面臨同樣的問題，因為類風濕因子跟很多種屬的抗體都會發(fā)生反應，簡單點說，比如你RBC用量探索的時候1ug/人份，效果就夠了1.5ug也行，就盡量用1.5ug。什么源的都會遇到一些問題，所以如何去屏蔽這些問題合理選擇RBC抗體種類及用量是一門學問啊。MJ：還有幾個小問題明天我就100mMtris+0.5%的S9pH=8.5作為母液上？篩選抗rbc種類和濃度T：就這個，先用最簡單的，這個沒問題之后再有針對性調整。有這樣的說法MJ：有這樣的說法，ph8.7最適合抗原抗體反應？還有brij35增加特異性是怎么回事兒？T:額，抗原抗體的反應，在體內，PH7.2左右是最合適的PH，但是在體外就不一定了，特別是當體系中含有其它各種組分的時候，這個最佳的PH就千差萬別了，所以一般來講每個項目每個原料都是要探索的。當然，很多時候，我們不會做的這么仔細一般做的東西做了，也就大概有個印象了。所以PH8.7這個說法就是欠揍。BRIJ35增加特異性的機理在于改變蛋白的三維構象進而使其容易產生非特異性反應的活躍位點隱藏起來，至于其如何達到這種效果的，不好解釋。影響蛋白三維構象的物質，歸根到底，就是那些可以影響氨基酸之間作用力的物質，比如疏水作用力對表面活性劑敏感，比如靜電作用力對PH和離子強度敏感。MJ：最后一個問題是：抗體、或者說蛋白，在我的印象里應該是液體保存在緩沖液里面的，固體在NC膜或者在金殿上我就認了，抗體直接放在樣品墊上，會不會很容易歇菜?T：抗體直接放在樣品墊上會吸附樣品墊的，就如同抗體容易吸附NC膜差不多，所以關于流動封閉其實有一種作用很多人都不知道。MJ:不是為了防止搞基么？還有什么作用？T：我們封閉樣品墊，比如我們在樣品墊上加酪蛋白或者BSA，其實有個很重要的作用是封閉樣品墊上的活性位點，比如玻纖上的活性位點。如果我們不封閉樣品墊，檢測肌鈣蛋白I，肌鈣蛋白是一種很容易吸附在玻纖上面的蛋白質，這樣檢測結果會偏低，所以，有