第三章-基因工程3

第三章基因工程制藥3目標(biāo)基因的高效表達(dá)

生物工程研究所浙江大學(xué)2009一概述

目的基因的表達(dá)效率是基因工程研究的核心問(wèn)題，而且是一個(gè)多角度的研究課題，一般具有如下規(guī)律：從表達(dá)蛋白的生物活性角度出發(fā)，目標(biāo)蛋白無(wú)須變性復(fù)性就具有生物活性的表達(dá)方式將是更有效的基因表達(dá)方式；從翻譯后修飾角度，目標(biāo)蛋白能夠進(jìn)行與其天然蛋白最接近的結(jié)構(gòu)修飾的基因表達(dá)將是更有效的基因表達(dá)方式；從表達(dá)定位角度，目標(biāo)蛋白能夠分泌到細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞外的分泌型表達(dá)將是更有效的基因表達(dá)；從質(zhì)粒穩(wěn)定性出發(fā)，目標(biāo)基因能夠長(zhǎng)時(shí)間在宿主菌中保持和表達(dá)的方式將是更有效的基因表達(dá)；從細(xì)胞生物量角度，重組菌容易高密度培養(yǎng)的表達(dá)方式將是更有效的基因表達(dá)；從蛋白質(zhì)分離角度，表達(dá)的蛋白形式最有利于后續(xù)分離的方式將是更有效的基因表達(dá)。二影響目的基因表達(dá)的基本因素

目標(biāo)基因的表達(dá)效率不僅取決于宿王菌特性和表達(dá)載體的構(gòu)建，而且還取決于重組菌的培養(yǎng)工程從表達(dá)系統(tǒng)來(lái)看，主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平上。從轉(zhuǎn)錄水平看，影響外源DNA轉(zhuǎn)錄的主要因素是啟動(dòng)子的強(qiáng)弱和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)從翻譯水平看，影響外源基因表達(dá)了重要因素是翻譯起始區(qū)和密碼子偏愛(ài)性針對(duì)已構(gòu)建的表達(dá)目標(biāo)基因的重組菌，采用合適的培養(yǎng)工程從而最大限度地發(fā)揮重組菌的表達(dá)潛力是重組菌培養(yǎng)工程的核心問(wèn)題三目的基因的不溶性高效表達(dá)

在基因工程誕生后研發(fā)第一代重組DNA產(chǎn)品時(shí)，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的somatostatin和胰島素都是細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白酶的良好降解底物，因而表達(dá)量很低。但當(dāng)與

-半乳糖苷酶融合表達(dá)的產(chǎn)物卻能在細(xì)胞內(nèi)高水平積累，從而開(kāi)創(chuàng)了目標(biāo)基因的高效融合表達(dá)策略。但融合表達(dá)的蛋白質(zhì)往往形成不溶性的無(wú)生物活性的包涵體，往往需要溶解和復(fù)性才能獲得有活性的目標(biāo)蛋白。由于高密度培養(yǎng)技術(shù)和蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)的發(fā)展，不溶性融合蛋白表達(dá)策略仍是一個(gè)提高目標(biāo)基因表達(dá)效率的基本策略。五目標(biāo)基因的高效分泌性表達(dá)目標(biāo)基因的分泌性表達(dá)有二種情形：

（1）目標(biāo)蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)中；（2）目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)后，再分泌到細(xì)胞外。

目標(biāo)蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)中的優(yōu)點(diǎn)有：1）細(xì)胞周質(zhì)中蛋白酶種類(lèi)和數(shù)量遠(yuǎn)少于細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)中，從而減少蛋白酶的攻擊；2）細(xì)胞周質(zhì)中高度氧化環(huán)境更有利于蛋白質(zhì)的正確折疊和增加可溶性；3）表達(dá)蛋白在分泌到細(xì)胞周質(zhì)的過(guò)程中能夠借助肽酶將與之相連的信號(hào)肽切除，從而得到成熟的表達(dá)蛋白；4）通過(guò)簡(jiǎn)單的滲透振擾就可將在細(xì)胞周質(zhì)中的目標(biāo)表達(dá)蛋白分泌到培養(yǎng)基中，避免了在分離過(guò)程中細(xì)胞破碎帶來(lái)的眾多雜蛋白的干擾。六基因工程宿主菌的改造代謝工程手段

1）降低磷酸轉(zhuǎn)移酶的活性，減少丙酮酸的合成2）通過(guò)降低磷酸轉(zhuǎn)乙酸基酶活性減少乙酸形成；3）通過(guò)加強(qiáng)6-磷酸葡萄糖合成糖元來(lái)減少丙酸的形成；4）通過(guò)克隆AcetolactateSynthase基因，將丙酮酸引向毒性小50倍以上的acetoine合成，從而減少乙酸的合成。

利用細(xì)胞培養(yǎng)工程手段提高基因表達(dá)水平

3個(gè)新問(wèn)題：1）與傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)不同，重組菌存在質(zhì)粒丟失趨向，而且不含質(zhì)粒的宿主菌比含質(zhì)粒的重組菌比生長(zhǎng)速率更快，因而隨著培養(yǎng)過(guò)程的延長(zhǎng)，不含質(zhì)粒的宿主菌比例將會(huì)越來(lái)越高，嚴(yán)重影響目的基因的表達(dá)效率；2）重組菌不僅要維持菌體的正常生長(zhǎng)而且還要表達(dá)外源基因，因此重組菌存在能量分流現(xiàn)象，從而限制了重組菌的高密度培養(yǎng)；3）在重組菌中表達(dá)的目標(biāo)蛋白，為細(xì)胞的異源物質(zhì)，往往存在一定程度的毒性，而且在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中亦會(huì)積累乙酸等抑制性有機(jī)酸，這些抑制性物質(zhì)將會(huì)嚴(yán)重抑制細(xì)胞生產(chǎn)和目標(biāo)基因的高表達(dá)。A）提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性

1）在質(zhì)粒構(gòu)建中，加入稱為par和cer位點(diǎn)，par位點(diǎn)能夠在細(xì)胞分裂過(guò)程中使質(zhì)粒分布更均勻，cer位點(diǎn)則能夠防止多聚體質(zhì)粒的形成，從而能從源頭上提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。2）采用各種方法減少菌體的生長(zhǎng)速率，提高重組細(xì)胞中的載體拷貝數(shù)，增加目標(biāo)蛋白的表達(dá)速率。3）采用細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)期分開(kāi)的培養(yǎng)策略，從而避免細(xì)胞生長(zhǎng)初期由于誘導(dǎo)表達(dá)導(dǎo)致的質(zhì)粒不穩(wěn)定性。4）采用培養(yǎng)條件循環(huán)控制策略，減少不帶質(zhì)粒的宿主菌的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，提高含質(zhì)粒重組菌的比例，從而提高表達(dá)產(chǎn)率。5）采用固定化細(xì)胞培養(yǎng)策略。B重組菌的高密度培養(yǎng)

非反饋補(bǔ)料恒速補(bǔ)料預(yù)先設(shè)定的恒定的營(yíng)養(yǎng)流加速率，細(xì)菌的比生長(zhǎng)速率逐漸下降，菌體密度呈線性增加。變速補(bǔ)料在培養(yǎng)過(guò)程中流加速率不斷增加（梯度、階段、線性等），細(xì)菌比生長(zhǎng)速率在不斷改變。指數(shù)補(bǔ)料流加速度呈指數(shù)增加，比生長(zhǎng)速率為恒定值，菌體密度呈指數(shù)加。反饋補(bǔ)料恒pH值法在線檢測(cè)葡萄糖或甘油濃度控制碳源的濃度。通過(guò)pH值的變化，推測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，調(diào)節(jié)流加葡萄糖速度，調(diào)節(jié)pH為恒定值。恒溶解氧法以溶解氧為反饋指標(biāo)，根據(jù)溶解氧的變化曲線調(diào)整碳源的流加量。菌體濃度反饋通過(guò)檢測(cè)菌體的濃度，擬合營(yíng)養(yǎng)的利用情況，調(diào)整碳源的加入量。CER法通過(guò)檢測(cè)二氧化碳的釋放率（CER），估計(jì)碳源的利用情況，控制營(yíng)養(yǎng)的流加。DO-stat法通過(guò)控制溶解氧，攪拌和補(bǔ)料速率，維持恒定的溶解氧，控制減少有機(jī)酸的生成。C減少乙酸等抑制性副產(chǎn)物的形成降低比生長(zhǎng)速率降低培養(yǎng)溫度

限制性流加葡萄糖

在線或離線除去乙酸D）目標(biāo)蛋白表達(dá)的質(zhì)量目標(biāo)蛋白常常會(huì)受到各種修飾，如蛋白質(zhì)的氧化、脫氨基和降解，而且各種修飾的蛋白質(zhì)難以從目標(biāo)蛋白分離除去，影響目標(biāo)蛋白質(zhì)的真實(shí)性和質(zhì)量，引起人體的許多副作用。

------二段培養(yǎng)、降低溫度真核蛋白質(zhì)翻譯后的修飾

------真核表達(dá)系統(tǒng)

基因工程的應(yīng)用與發(fā)展前景 一、基因工程制藥重組的治療性蛋白質(zhì)藥物、重組疫苗單克隆抗體

干擾素人表皮生長(zhǎng)因子人防御素重組人表皮生長(zhǎng)因子二、植物基因工程定義

基本方法：土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法A抗除草劑基因工程

1）將除草劑作用的酶或蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)進(jìn)植物，使其拷貝數(shù)增加，使轉(zhuǎn)基因作物中這種酶或蛋白質(zhì)的量大大增加，因而除草劑不能殺死該植物：2）以除草劑為底物的酶的基因轉(zhuǎn)到植物中，該基因編碼的酶在轉(zhuǎn)基因作物中將除草劑催化，達(dá)到保護(hù)植物的目的；3）還有一種是利用除草劑能識(shí)別其代碼作用的酶上一定位點(diǎn)的這一特點(diǎn)，用基因突變的方法使該位點(diǎn)上相應(yīng)的氨基酸發(fā)生突變，除草劑不能識(shí)別而使轉(zhuǎn)基因作物對(duì)除草劑不敏感?，F(xiàn)已獲得的抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物有大豆、棉花、玉米、水稻、甜菜等20多種，抗除草劑的轉(zhuǎn)基因作物占總的轉(zhuǎn)基因作物的70%以上B抗蟲(chóng)基因工程

根據(jù)抗蟲(chóng)基因的來(lái)源，分為從細(xì)菌中分離出來(lái)的抗蟲(chóng)基因，主要是蘇云金桿菌毒蛋白基因；從植物組織中分離出的抗蟲(chóng)基因，主要為蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因等；從動(dòng)物體內(nèi)分離的毒素基因，主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等。C抗病基因工程

對(duì)植物造成重要危害的病原生物主要有病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲(chóng)等，目前對(duì)前3種病原具有一定抗性作用的轉(zhuǎn)基因都已培育出來(lái)，轉(zhuǎn)基因抗病作物已達(dá)十余種，2000年種植面積達(dá)8