第八章 生物藥物的分離純化技術(shù)

第八章生物藥物的分離純化技術(shù)第一節(jié)概述生物制藥：上游工程和下游工程；生物藥品雜質(zhì)來源：（１）培養(yǎng)基成分的未被完全利用（２）上游環(huán)節(jié)帶入或產(chǎn)生的生物體或代謝產(chǎn)物．如病毒，外源蛋白，熱原等．第一節(jié)概述（一）生物藥品的特點(diǎn)：（１）具有生物活性，穩(wěn)定性受ＰＨ，溫度，離子強(qiáng)度，溶劑，表面活性劑，金屬離子等影響；（２）分子量越大，穩(wěn)定性越差；（３）分離純化條件要求溫和；（４）產(chǎn)品純度要求高，多為結(jié)晶態(tài)．第一節(jié)概述（二）提取純化的基本工藝流程預(yù)處理；固液分離；濃縮；純化；產(chǎn)品定型．盡可能減少操作步驟，提高回收率第一節(jié)概述（三）生物分離純化技術(shù)：（１）固相析出分離技術(shù)（２）吸附法（３）離子交換法（４）層析技術(shù)（５）高效液相色譜技術(shù)（６）膜分離技術(shù)第二節(jié)固相析出分離法

一概述１定義：許多生化目的物常作為溶質(zhì)存在于溶液中，改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出的操作技術(shù)稱為固相析出分離法．２分類：（１）鹽析法（２）有機(jī)溶劑沉淀法（３）等電點(diǎn)沉淀法（４）結(jié)晶法

第二節(jié)固相析出分離法（一）鹽析法（１）定義：鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達(dá)到純化目的的方法．（一）鹽析法

（２）優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)，簡(jiǎn)便，安全，較少引起生物分子變性．

缺點(diǎn)：析出物中含有大量鹽析劑，常用硫酸銨易分解產(chǎn)生氨有惡臭味，不能直接用于醫(yī)藥中；初提取方法，結(jié)合精制手段才能得到高純度產(chǎn)品．（一）鹽析法

（３）鹽析的機(jī)制：高濃度的中性鹽溶液中存在著大量的帶電荷的鹽離子，它們能夠中和生物分子表面的電荷，使之賴以穩(wěn)定的雙電層受損，從而破壞分子外圍的水化層；另外，大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，從另一方面摧毀了水化層，使生物分子相互聚集而沉淀。（一）鹽析法（４）鹽析的分類：①Ｋs鹽析法：在一定ＰＨ和溫度下改變離子強(qiáng)度（鹽濃度）進(jìn)行鹽析．特點(diǎn)：分辨率不高，早期分離．②β鹽析法：在一定離子強(qiáng)度下僅改變ＰＨ和溫度進(jìn)行鹽析．特點(diǎn)：分辨率高，用于結(jié)晶前的分離．（一）鹽析法（５）影響鹽析的因素：１無(wú)機(jī)鹽的種類：①鹽析作用要強(qiáng)常選用多價(jià)陰離子．②鹽要有足夠大的溶解度，且受溫度影響?。埯}的生物學(xué)是惰性的，不影響生物分子的活性．常用硫酸銨，其次是硫酸鈉和磷酸鹽．（５）影響鹽析的因素２溶質(zhì)種類的影響不同蛋白質(zhì)鹽析沉淀所用的無(wú)機(jī)鹽的用量不同．利用此特點(diǎn)可采取先后加入不同無(wú)機(jī)鹽的辦法來分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)，以達(dá)到分離目的．（５）影響鹽析的因素３蛋白質(zhì)濃度的影響濃度不同，沉淀所用無(wú)機(jī)鹽的用量也不同．一般情況隨蛋白質(zhì)濃度提高鹽用量減少．４溫度的影響大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度隨溫度升高而增大，但在高鹽溶液中常相反．因此，溫度適當(dāng)提高有利于蛋白質(zhì)沉淀，但必須考慮其穩(wěn)定性．（５）影響鹽析的因素５ＰＨ的影響：調(diào)節(jié)溶液ＰＨ于目的物等電點(diǎn)附近，再加入飽和硫酸銨，并注意加入的速度．注意加入的鹽會(huì)影響目的物等電點(diǎn)的偏移．一般來說，與陰離子結(jié)合等電點(diǎn)向酸側(cè)偏移，與陽(yáng)離子結(jié)合等電點(diǎn)向高ＰＨ側(cè)偏移．

（一）鹽析法（６）鹽析的操作１鹽析劑量的確定２在目的物最穩(wěn)定的ＰＨ前提下，考慮最適宜酶沉淀的ＰＨ；加入硫酸銨要注意攪拌和速度；大多數(shù)酶要求低溫下進(jìn)行；目的物沉淀下來要靜置．（一）鹽析法（６）鹽析的操作３分級(jí)鹽析：先以較低濃度鹽除去部分雜蛋白，再提高鹽的飽和度沉淀目的物．４反抽提法：先在一定鹽濃度下將目的蛋白夾帶一定數(shù)量的雜蛋白一同沉淀，然后再將沉淀用較低濃度鹽溶解，溶出其中的雜蛋白，達(dá)到純化目的．（一）鹽析法（６）鹽析的操作5鹽析注意事項(xiàng)：ⅰ固體鹽投入法，須先將鹽粒磨細(xì)，在不斷攪拌下分批緩緩加入到溶液中，邊加邊溶，不使容器底部留下未溶的固體鹽，可以避免因局部過濃造成蛋白質(zhì)變性．ⅱ溫度多在室溫下進(jìn)行，少數(shù)不穩(wěn)定的則在0～１０℃進(jìn)行．（二）有機(jī)溶劑沉淀法（１）定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。（２）機(jī)理：①親水性有機(jī)溶劑加入溶液后降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使得溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。②水溶性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度，降低了它的親水性，導(dǎo)致脫水凝集。（二）有機(jī)溶劑沉淀法（３）與鹽析法比較：優(yōu)點(diǎn)：溶劑易揮發(fā)不殘留，產(chǎn)品更純凈；沉淀物與母液密謀差大分離容易．缺點(diǎn)：易使蛋白質(zhì)變性；需在低溫下進(jìn)行；易燃易爆注意防護(hù)安全．（二）有機(jī)溶劑沉淀法（４）有機(jī)溶劑的選擇：甲醇，乙醇和異丙醇；其中乙醇最常用．（５）有機(jī)溶劑沉淀操作：采用稀的有機(jī)溶劑，低溫進(jìn)行，沉淀后得到的蛋白質(zhì)目的物要盡快加水溶解．（二）有機(jī)溶劑沉淀法（６）影響沉淀的因素１溶劑的種類和用量乙醇應(yīng)用最廣，沉淀作用強(qiáng)，沸點(diǎn)適中，無(wú)毒，廣泛應(yīng)用城蛋白質(zhì)核酸多糖氨基酸等分離．２ＰＨ的影響溶液ＰＨ對(duì)溶劑的沉淀效果影響很大，選用在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近的ＰＨ．同時(shí)注意滿足蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性不變．（二）有機(jī)溶劑沉淀法（６）影響沉淀的因素