細(xì)胞超微標(biāo)技術(shù)

細(xì)胞超微標(biāo)記示蹤技術(shù)前言近十幾年來(lái)，國(guó)際上創(chuàng)造出許多細(xì)胞超微標(biāo)記與示蹤的細(xì)胞化學(xué)新技術(shù)，因而可以進(jìn)一步定性、定位和定量地分析某些特定的化學(xué)成分、物質(zhì)結(jié)構(gòu)及其功能意義。用各種高電子密度的離子、分子或顆粒顯示組織、細(xì)胞的通透性、孔徑、通道或屏障以及某種帶負(fù)電荷結(jié)構(gòu)。IF:12.186(2011)Chithranietal.NanoLett.2006DependenceofcellularuptakeofgoldnanoparticlesasafunctionofsizeThegraphofnumberofgoldnanoparticlespervesiclediametervsnanoparticlesizeChithranietal.NanoLett.2006(B-F)TEMimagesofgoldnanoparticleswithsizes14,30,50,74,and100nmtrappedinsidevesiclesofaHeLacell,respectively.正常細(xì)胞與納米材料的表面形態(tài)ZnONPsTiO2P25controlcontrolZnONPs附著于膠質(zhì)細(xì)胞表面引起質(zhì)膜表面囊泡結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生ZnONPs6hZnONPs12hZnONPs6hZnONPs12h細(xì)胞表面囊泡增加ZnO材料與細(xì)胞膜發(fā)生相互作用TiO2P25導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面囊泡的聚集TiO2P256hTiO2P2512hTiO2P256hTiO2P2512hTiO2聚集于細(xì)胞表面細(xì)胞表面大量囊泡結(jié)構(gòu)6hexposuremicroglia18hpostexposure第一節(jié)超微標(biāo)記示蹤技術(shù)的分類(lèi)和評(píng)價(jià)非特異性標(biāo)記示蹤技術(shù)（一）重金屬真溶液標(biāo)記（二）陽(yáng)離子染料（三）酶與金屬蛋白類(lèi)特異性標(biāo)記示蹤技術(shù)（一）彌散性標(biāo)記物（二）顆粒性標(biāo)記物第一節(jié)超微標(biāo)記示蹤技術(shù)的分類(lèi)和評(píng)價(jià)

一、非特異性標(biāo)記示蹤技術(shù)（一）重金屬真溶液標(biāo)記如釕紅、硝酸鑭以及葡萄糖酸亞鐵等化合物中的重金屬，分子小，電子致密度高，所標(biāo)記的生物標(biāo)本可以在電鏡下觀察和研究某種組織、細(xì)胞的通透性。這些重金屬鹽可以通過(guò)細(xì)胞連結(jié)和縫隙連接的小管，進(jìn)入細(xì)胞間隙和相鄰細(xì)胞，但不能進(jìn)入完整、未受損傷的細(xì)胞。（二）陽(yáng)離子染料如陽(yáng)離子鐵蛋白，著染帶有負(fù)電荷的結(jié)構(gòu)。（三）酶與金屬蛋白類(lèi)主要是辣根過(guò)氧化物和鐵蛋白。前者用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）注入機(jī)體的細(xì)胞、組織或器官，再用3.3-氨基聯(lián)苯胺（DAB）與其進(jìn)行組織化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生顯色物質(zhì)。該產(chǎn)物強(qiáng)嗜鋨，因而電鏡下也能著色示蹤。多用于研究小蛋白的追蹤、通透性及神經(jīng)通路。鐵蛋白也可用來(lái)示蹤研究通透性。二、特異性標(biāo)示技術(shù)（一）彌散性標(biāo)記物

1.放射自顯影術(shù)

2.酶標(biāo)記抗體或特異性復(fù)合物

3.可溶性（非標(biāo)記）酶和抗酶復(fù)合物（PAP）

4.生物素和卵白素（Biotin-avidin）復(fù)合標(biāo)記（二）顆粒性標(biāo)記物1.鐵蛋白標(biāo)記復(fù)合物；2.各種微球體標(biāo)記物3.生物大分子標(biāo)記物，如α-2巨球蛋白；4.金標(biāo)記復(fù)合物作為一項(xiàng)理想的技術(shù)方法，應(yīng)具有多功能、多用途，既能用于透射電鏡，也能用于掃描電鏡和X線衍射分析。金標(biāo)記技術(shù)能滿足這些要求，是很有價(jià)值的標(biāo)記示蹤技術(shù)。磁性－熒光多功能復(fù)合微球制備原理圖Fe3O4納米粒子的TEM圖Fe3O4@SiO2的透射電鏡TEM圖第二節(jié)鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)

鐵蛋白是含鐵的大分子，電子密度高，分子量為500,000~800,000。分子核心是磷酸羥化鐵，外包蛋白質(zhì)殼，總直徑小于12nm。透射電鏡下為高電子密度的細(xì)小顆粒。一、離子化鐵蛋白技術(shù)：是一種非特異性標(biāo)記技術(shù)，利用陽(yáng)離子化鐵蛋白和陰離子化鐵蛋白標(biāo)記細(xì)胞中具有負(fù)電荷或正電荷的結(jié)構(gòu)。二、鐵蛋白標(biāo)記抗體的免疫電鏡技術(shù)：細(xì)胞與鐵蛋白標(biāo)記的抗體共同孵育、染色、包埋、超薄切片。在透射電鏡下借助于鐵蛋白的高電子密度，可以精確地、特異地顯示出相應(yīng)抗原的位置、分布。若用鐵蛋白標(biāo)記配體或其他物質(zhì)，則可以顯示、研究膜受體及膜特性。此法的缺點(diǎn)是制備繁雜困難，鐵蛋白顆粒過(guò)于細(xì)小不便觀察，超薄切片上非特異性反應(yīng)很強(qiáng)。

親和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和糖基化鐵蛋白技術(shù)的應(yīng)用。親和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的基本原理是將鐵蛋白與生物素交聯(lián)，利用生物素對(duì)卵白蛋白的高親和力、以生物素－卵白蛋白－配體（或抗體）為橋，將鐵蛋白標(biāo)記在細(xì)胞的特定結(jié)構(gòu)或物質(zhì)上，以觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及化學(xué)性質(zhì)。使用生物素－卵白蛋白標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是方法靈敏，非特異性低，親和力極強(qiáng)，可以進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記，簡(jiǎn)單方便，可以?xún)H制備保存一種標(biāo)記卵白素或標(biāo)記生物素，而進(jìn)行多種反應(yīng)，以顯示多種特定的物質(zhì)結(jié)構(gòu)。第三節(jié)金微粒（膠體金）標(biāo)記技術(shù)一、金標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：1.膠體金的制備容易、簡(jiǎn)單、便宜2.幾乎不出現(xiàn)非特異性吸附、標(biāo)記3.可用不同的試劑和濃度嚴(yán)格控制所需金微粒的大小4.能用多種方法定量分析標(biāo)記到細(xì)胞表面的金微粒5.膠體金可以與抗體、多糖、外源凝集素和其他多種蛋白質(zhì)相連，生成標(biāo)記大分子而不影響大分子的生物活性，用途廣泛6.可用于掃描電鏡和X線衍射分析，這是其他標(biāo)記物無(wú)法比擬的二、膠體金的特性、穩(wěn)定性基標(biāo)記原理

膠體金的特性主要取決于金微粒的直徑、吸收光譜及其穩(wěn)定性。金微粒的大小可以用透射電鏡直接測(cè)定。國(guó)際上通用的標(biāo)示方法如WGA-Au5。膠體金是一種疏水膠體，由吸附的周?chē)x子云維持膠體的穩(wěn)定性。膠體金的穩(wěn)定性取決于膠體粒子的大小，顆粒越小越穩(wěn)定，越不容易受電解質(zhì)的干擾而凝聚。目前已有三種穩(wěn)定金屬膠體溶液防止凝聚的方法。（1）膠體顆粒表面吸附表面活性物質(zhì)（如肥皂）以增加表面電荷密度及潛能。（2）吸附親水大分子以降低粒子間的吸引力。（3）吸附高分子多聚體以增加膠體溶液的立體穩(wěn)定性。

此外，多糖和其他多聚物也能提高其立體穩(wěn)定性。典型樣品的透射電子顯微鏡圖(a)Fe3O4;(b)氨基化Fe3O4;(c)膠體金;(d)Fe3O4/Au(15-20nm)王顯祥等，科學(xué)通報(bào).2009;54(4):430-435直徑16~20nm的膠體金的制備：

用干凈非金屬藥勺和容器稱(chēng)氯金酸50mg，溶于500ml三蒸水中，制成0.01%的氯金酸液，煮沸，快速加入1%枸掾酸鈉12.5ml，邊加邊攪拌邊加熱，至5min左右溶液由黃、藍(lán)，變成深紅色。冷卻后用碳酸鉀溶液調(diào)pH。注意：

玻璃器皿應(yīng)非常潔凈，實(shí)際加入的次序要正確，應(yīng)用高純度的去離子水。注意顏色的變化:

電鏡下金微粒應(yīng)為圓球形或橢圓形的電子致密顆粒，不得有微粒的聚集凝結(jié)，而應(yīng)完全呈現(xiàn)單個(gè)分散狀態(tài)?？稍跓o(wú)菌或特殊處理情況下保存數(shù)月。四、金標(biāo)記物的制備（一）制備大分子被標(biāo)記物中含有無(wú)機(jī)鹽時(shí)，會(huì)降低膠體顆粒間的排斥電荷，招致膠體凝聚或影響大分子的吸附和標(biāo)記，為此，需對(duì)金標(biāo)記的大分子進(jìn)行純化或透析。（二）金微粒標(biāo)記先要測(cè)定標(biāo)記大分子最適宜的標(biāo)記量、最適宜pH，以求得最佳的標(biāo)記效果和最穩(wěn)定的金標(biāo)記物溶液。此外，金和大分子蛋白間的等電點(diǎn)有關(guān)，蛋白質(zhì)與金結(jié)合的最佳點(diǎn)是在等電點(diǎn)或稍微偏堿。若膠體金的pH不合適、膠體金顆粒太大，被標(biāo)記物質(zhì)的分子過(guò)小、數(shù)量過(guò)少，則易引起金粒凝集。這時(shí)可用小牛血清白蛋白與小肽交聯(lián)后，在進(jìn)行金標(biāo)記。五、膠體金標(biāo)記物的應(yīng)用和研究（一）光鏡中的應(yīng)用標(biāo)記物在光鏡下為桔紅色。金標(biāo)IgG在普通光鏡下計(jì)數(shù)組織、細(xì)胞。應(yīng)用Au-rhodamineCo