稀土熒光探針檢測(cè)多巴胺及類似物

稀土熒光探針檢測(cè)

多巴胺及類似物答辯人：袁潔導(dǎo)師：趙美萍副教授2003年6月18日選題背景已有檢測(cè)方法綜述實(shí)驗(yàn)部分總結(jié)致謝兒茶酚胺的結(jié)構(gòu)

及生理意義兒茶酚胺（catecholamine,CA）的種類、結(jié)構(gòu)和生理意義神經(jīng)遞質(zhì)在單細(xì)胞檢測(cè)中的意義Dopamine（DA）瑞典神經(jīng)藥理學(xué)家Carlsson于1958年首次提出腦內(nèi)多巴胺(DA)是獨(dú)立的神經(jīng)遞質(zhì)

正常值范圍為血漿：＜888pmol/L；尿：424-2612nmo1/24h。增高會(huì)引起嗜鉻細(xì)胞瘤，心肌梗塞，糖尿病酮癥酸中毒等一系列疾病。而其含量的降低會(huì)引起植物神經(jīng)病變，帕金森病等。

Epinephrine（E）&

norepinephrine（NE）

在人體內(nèi)的正常值范圍為血漿：＜480pmo1/L；尿：0-80nmo1/24h在人體內(nèi)的正常值范圍為血漿：615-3240pmol/L；尿：0-590nmol/24h對(duì)兒茶酚胺的檢測(cè)手段

檢測(cè)方法靈敏度優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)放射酶學(xué)法2.2×10-10M,靈敏度高，選擇性好技術(shù)難度高，檢測(cè)速度慢，危險(xiǎn)

HPLC法

depends分離效果好，可結(jié)合不同檢測(cè)器應(yīng)用流動(dòng)相有可能影響檢測(cè)效果熒光測(cè)定法(THI、EDA)

10–10M-10–9M（改良后）常規(guī)使用，改良后靈敏度較高樣品處理程序復(fù)雜，特異性不高

電化學(xué)分析法

10–6M-10–5M能排除抗壞血酸的影響，重現(xiàn)性較好

靈敏度低,只是針對(duì)DA檢測(cè),仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段

毛細(xì)管電泳（CE）法

10-8M（depends）分離高效,耗樣量少

靈敏度尚不高稀土熒光探針?lè)?0-8M簡(jiǎn)便，可以與各種分離手段聯(lián)用靈敏度不夠高稀土熒光探針檢測(cè)

兒茶酚類化合物的原理單純的TbCl3，Tb-DCTA體系和DOPAC在實(shí)驗(yàn)用的波長(zhǎng)條件下(298nm,546.8nm)都沒(méi)有熒光信號(hào)，可見(jiàn)體系發(fā)光是由于形成了Tb-DCTA－DOPAC三重絡(luò)合物并發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移得結(jié)果。DOPAC的熒光圖紅：激發(fā)波長(zhǎng)為279nm藍(lán)：激發(fā)波長(zhǎng)為298nmTbCl3的熒光圖紅：激發(fā)波長(zhǎng)為298nm藍(lán)：激發(fā)波長(zhǎng)為240nmTb－DCTA熒光圖玫紅：激發(fā)波長(zhǎng)為240nm綠：激發(fā)波長(zhǎng)為240nm（三重絡(luò)合物，Tb－DCTA濃度同上）綠：激發(fā)波長(zhǎng)為298nmTb－DCTA－DOPAC體系熒光圖綠：激發(fā)波長(zhǎng)為240nm紅：激發(fā)波長(zhǎng)為279nm藍(lán)：激發(fā)波長(zhǎng)為298nm1.三元絡(luò)合物的形成三元絡(luò)合物體系：1.離子締合三元絡(luò)合物2.金屬離子先后結(jié)合兩種配體形成三元絡(luò)合物Tb－DCTA－CAs體系：Tb與DCTA先行絡(luò)合，然后Tb余下的空位再與CAs絡(luò)合，形成三重絡(luò)合體系

2.三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理(1)配體受激后,單重態(tài)（S1）有三種方式退激：a.產(chǎn)生熒光的輻射躍遷(S1-S0)b.系間竄躍(S1-T1)c.無(wú)輻射躍遷回基態(tài)(ISC)三重態(tài)（T1）也有三種退激方式：a.產(chǎn)生磷光的輻射躍遷(T1-S0)b.通過(guò)無(wú)輻射轉(zhuǎn)移躍遷到Tb3＋的激發(fā)態(tài)(ET)，c.無(wú)輻射躍遷回基態(tài)(T1～S0)。2.三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理(2)分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)換效率的影響因素：1.配體最低的激發(fā)三重態(tài)（T1）能量高于Tb的5D4能級(jí)的能量2.能量轉(zhuǎn)移的速率大于三重態(tài)無(wú)輻射退激的速率3.從配體激發(fā)單重態(tài)向三重態(tài)系間竄躍的速率和幾率相當(dāng)高2.三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理(3)兒茶酚胺的磷光發(fā)射波長(zhǎng)在409

nm－417nm，亦即其三重態(tài)（T1）的能量高于Tb3＋的5D4能級(jí)約3800-4000cm－1高量子產(chǎn)率和躍遷幾率能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)高達(dá)1010s－1由水或解離的氧導(dǎo)致的配體三重態(tài)（T1）以及Tb3＋，發(fā)光的猝滅也大大減少了。實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 稀土離子與第一配體的選擇：1.Eu3＋+EDTA體系；2.Eu3＋＋phen體系；

小結(jié)：最終棄用這兩個(gè)體系的原因，是其適用的pH范圍太低，難以使DA的羥基充分解離形成三元絡(luò)合物。實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化稀土離子與第一配體的選擇：

3.Tb3＋+EDTA體系（1）：

Tb:EDTA＝1:1（濃度均為2mmol/L）,

pH＝11,λex＝300nm，λem＝545nm,加入甲醇（分析純）、CsCl、TOPO等嘗試敏化,無(wú)法得到滿意檢測(cè)限，DA為10－5

mol/L小結(jié)：目前研究最多的體系，適用的pH相對(duì)于前兩個(gè)體系有了很大提高，但是仍然未能達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果

實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化稀土離子與第一配體的選擇：

3.Tb3＋+EDTA體系（2）：

Tb:EDTA＝1:1（濃度均為2mmol/L）,pH＝11,λex＝240nm，λem＝545nm,出現(xiàn)遞減結(jié)果小結(jié)：在λex＝240nm，λem＝545nm,出現(xiàn)的Tb3＋特征波長(zhǎng)處的遞減結(jié)果，可能是由于在檢測(cè)條件下,Tb－EDTA體系能發(fā)出Tb3＋的特征熒光，而待測(cè)物與之形成三重絡(luò)合體系后,激發(fā)波長(zhǎng)紅移，亦即三重絡(luò)合體系的形成導(dǎo)致了一部分Tb3＋特征熒光的猝滅。A．CDOPAC－Fluro圖B．CDA-Fluro圖實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化稀土離子與第一配體的選擇：4.Tb3＋+DCTA體系：20oC時(shí)，Tb3＋與EDTA的絡(luò)合常數(shù)lgK1為17.93，而與DCTA的絡(luò)合常數(shù)lgK1為20.20*

因此本體系可以在更高pH下存在，更利于三重絡(luò)合物形成pH