甲醛dna斷裂的檢測(cè)方法及機(jī)制

甲醛dna斷裂的檢測(cè)方法及機(jī)制

盔甲是遺傳毒性和起源性物質(zhì)，可導(dǎo)致dna鏈斷裂（sdb）、dna-dc）和dna-蛋白質(zhì)耦合（dna-a）。其中，dpc在致癌性和致動(dòng)性方面發(fā)揮著重要作用。就甲醛所致DNA斷裂、DNA-DNA交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)這三種效應(yīng)的檢測(cè)方法、量效關(guān)系、形成機(jī)理、修復(fù)機(jī)制予以介紹。1甲醇反應(yīng)和dna斷開1.1kohn法DNA斷裂常用的檢測(cè)方法有:堿解旋法,堿洗提法和單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)。(1)堿解旋法:堿解旋技術(shù)是依據(jù)在一定溫度和PH值下,DNA雙鏈的解旋發(fā)生在DNA分子內(nèi)單鏈斷裂的部位這一性質(zhì)而建立的,經(jīng)過一段時(shí)間的堿解旋后,溶液中雙鏈DNA分子的量與反應(yīng)前DNA分子中單鏈斷裂的數(shù)目成反比;(2)堿洗提法:堿洗提技術(shù)是Kohn于1976年首先提出,可用于檢測(cè)DNA分子單鏈或雙鏈斷裂。堿洗提法是把待測(cè)細(xì)胞放在濾膜上,先用弱堿進(jìn)行裂解,通過濾膜除去大部分蛋白質(zhì)和RNA,而DNA則原封不動(dòng)的保存在膜上,然后加入高PH值的堿洗提液,DNA完全裂解,DNA單鏈隨堿洗提液流過濾膜時(shí)DNA膜上保存率(濾膜浸出液DNA的含量/DNA總量)與其長(zhǎng)度存在依賴關(guān)系。此方法相對(duì)于堿解旋法來說使用更廣泛,但也有些不足之處,如操作需特別細(xì)心且耗時(shí)較長(zhǎng);(3)單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù),也稱彗星試驗(yàn),即將細(xì)胞包埋在瓊脂糖中,鋪于磨毛的載玻片上,凝固后浸入冷溶解液中使細(xì)胞裂解,在電泳液中解鏈后進(jìn)行水平電泳,洗滌后用DNA結(jié)合熒光染料染色,在熒光顯微鏡下觀察玻片上細(xì)胞的熒光圖象,評(píng)價(jià)DNA的損傷程度。本方法優(yōu)點(diǎn)是:簡(jiǎn)便,快速,靈敏度高,所需細(xì)胞少;本方法的缺點(diǎn)主要是不能直接區(qū)分DNA斷裂、DNA-DNA交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)這三種損傷效應(yīng)。1.2甲醛與肝胰腺的作用甲醛能否導(dǎo)致DNA分子斷裂,學(xué)界一直沒能達(dá)成共識(shí)。OliverMerk等對(duì)甲醛的遺傳毒性作了多次研究,但卻沒能發(fā)現(xiàn)甲醛具有斷裂作用,國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)此也進(jìn)行過多項(xiàng)研究,多數(shù)研究者也認(rèn)為甲醛沒有斷裂作用;但是唐國(guó)慧利用HL60人白血病細(xì)胞和楊丹鳳利用大白鼠肝細(xì)胞分別進(jìn)行研究,卻發(fā)現(xiàn)甲醛在5μmol/L和10μmol/L時(shí)都能引起DNA鏈的斷裂;襲著革等利用甲醛對(duì)健康雌性昆明小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行染毒,也發(fā)現(xiàn)低濃度的甲醛能夠引起DNA斷裂;本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)長(zhǎng)期研究,也發(fā)現(xiàn)分別經(jīng)5μmol/L,7.5μmol/L和10μmol/L甲醛染毒,人體口腔頰黏膜細(xì)胞DNA也有斷裂作用發(fā)生,且甲醛導(dǎo)致DNA斷裂的峰值濃度位于7.5μmol/L左右。1.3甲醛的氧化作用應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)對(duì)DNA斷裂進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)加入自由基清除劑可以顯著地抑制甲醛所致的DNA斷裂,提示甲醛主要是通過活性氧自由基,特別是羥自由基來介導(dǎo)DNA斷裂。甲醛可以通過以下三種途徑產(chǎn)生活性氧自由基,引起氧化壓力的增加:(1)甲醛可以損害生物或細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng),如引起超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性的降低,以及抗氧化物質(zhì)如還原型GSH的耗竭等;(2)甲醛作為一種親電子劑,作為一種自由基及弱氧化劑,進(jìn)入機(jī)體或細(xì)胞后可發(fā)生類似Fenton反應(yīng)的化學(xué)過程,作用類似于過氧化氫,產(chǎn)生羥自由基等強(qiáng)氧化劑,進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激對(duì)生物大分子造成損傷;(3)甲醛進(jìn)入細(xì)胞后可以打開線粒體上的線粒體滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道,降低線粒體膜電位,抑制線粒體的呼吸作用,產(chǎn)生更多的活性氧自由基(ROS),使得細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)的氧化壓力增加。即甲醛可以通過多種途徑破壞機(jī)體的氧化平衡狀態(tài),使得機(jī)體內(nèi)的ROS水平增加,進(jìn)而對(duì)核苷酸進(jìn)行攻擊產(chǎn)生DNA斷裂。1.4胞分裂所需要的dna復(fù)制過程DNA斷裂如果不能及時(shí)修復(fù),就會(huì)導(dǎo)致突變,更關(guān)鍵的是,它還會(huì)阻礙細(xì)胞分裂所必需的DNA復(fù)制過程,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在生物體長(zhǎng)期進(jìn)化過程中,正常細(xì)胞形成了一套十分有效的DNA修復(fù)系統(tǒng),從而可使受損傷的DNA分子迅速恢復(fù)正常,使細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性和正常功能得以保持而不致發(fā)生惡變。1.4.1為了恢復(fù)dna分子鏈ssbs的單鏈斷裂，通常需要切割和修復(fù)切除修復(fù)即將DNA分子中受損傷部分切除掉,并以完整的那一條為模板,合成切除的部分,然后使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。1.4.2ku自身抗原該修復(fù)主要依靠一種DNA依賴的蛋白激酶(DNA-PK),DNA-PK主要由兩個(gè)蛋白質(zhì)組成:含有催化亞基的P350和與雙鏈DNA作用的Ku自身抗原,后者是一個(gè)分子量為70/80Ku(KD)的二聚體。具體修復(fù)機(jī)制是:70/80Ku二聚體結(jié)合DSBs的斷端,然后由催化亞單位P350作用,使必需蛋白質(zhì)磷酸化,將斷端重新接起來。2外來物理的影響從代謝生理的角度上看,DNA-DNA的交聯(lián)是甲醛正常代謝的一種方式,因此,正常的細(xì)胞中存在著微量的DNA-DNA交聯(lián)產(chǎn)物。當(dāng)有外來物理,化學(xué)因素如射線、烷化劑、甲醛以及一些金屬化合物如鎳等直接或間接的作用時(shí),則可誘導(dǎo)出過量的DNA-DNA交聯(lián)。這些DNA-DNA交聯(lián)必將對(duì)DNA的構(gòu)象和功能(復(fù)制與轉(zhuǎn)錄)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,并在其復(fù)制過程中造成某些重要基因(如抑癌基因)的丟失,從而對(duì)生物體造成嚴(yán)重的危害。由于DNA-DNA交聯(lián)對(duì)生物體的危害較大,所以也引起了不少學(xué)者的重視。2.1檢測(cè)dna連接的方法DNA-DNA交聯(lián)常用的檢測(cè)方法有:堿洗提法,單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)。2.2甲醛濃度對(duì)dna-dna積極作用的影響許多研究都發(fā)現(xiàn)一定濃度的甲醛可以誘導(dǎo)DNA-DNA的交聯(lián)。OliverMerk和C.CliffordConaway等在不同的實(shí)驗(yàn)中都發(fā)現(xiàn)一定濃度的甲醛都可以導(dǎo)致DNA-DNA交聯(lián);襲著革等在使用不同濃度甲醛對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞作用時(shí),也發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醛濃度達(dá)到0.3584mmol/L時(shí)可以引起DNA-DNA的交聯(lián);本實(shí)驗(yàn)室研究也發(fā)現(xiàn)甲醛在較低濃度(<10μmol/L)時(shí)可以導(dǎo)致人體口腔頰黏膜細(xì)胞DNA鏈斷裂,但在較高濃度(>15μmol/L)時(shí)可以導(dǎo)致DNA-DNA交聯(lián)。2.3甲醛-甲基概述國(guó)內(nèi)外學(xué)者雖然針對(duì)甲醛導(dǎo)致DNA-DNA交聯(lián)進(jìn)行了很多研究,但確切機(jī)理還不是很清楚。甲醛所致的DNA-DNA交聯(lián),分為鏈內(nèi)交聯(lián)和鏈間交聯(lián),主要發(fā)生在A、G、C堿基自身或三者之間,但不形成C-C交聯(lián)。其大致機(jī)理可能是:(1)甲醛主要通過活性氧自由基,特別是羥自由基來介導(dǎo)DNA-DNA的交聯(lián)。(2)甲醛是一種簡(jiǎn)單的小分子,其毒性效應(yīng)的一個(gè)重要方面是源于它的羰基親電性和較小的空間位阻,使其易于與核酸發(fā)生交聯(lián)。在體內(nèi)或體外甲醛先與核酸上的自由的氨基反應(yīng)生成不穩(wěn)定的羥甲基加合物,然后再進(jìn)一步與其他核酸反應(yīng)形成穩(wěn)定的交聯(lián)物,其主要形式是:DNA-NH-CH2-NH-DNA。2.4子鏈dna缺口救濟(jì)DNA-DNA交聯(lián)的修復(fù)可能是由幾種修復(fù)系統(tǒng)共同完成,主要的修復(fù)系統(tǒng)是切除修復(fù)和重組修復(fù)。重組修復(fù)的主要機(jī)制是:(1)受損傷的DNA鏈復(fù)制時(shí),產(chǎn)生的子代DNA在損傷的對(duì)應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。(2)另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組交換,將母鏈DNA上相應(yīng)的片段填補(bǔ)子鏈缺口處,而母鏈DNA出現(xiàn)缺口。(3)以另一條子鏈DNA為模板,經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補(bǔ)母鏈DNA的缺口,最后由DNA連接酶連接,完成修補(bǔ)。3dpc與其他dna損傷的連通性在正常細(xì)胞中存在著一定量的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián),這是DNA與核蛋白的正常聯(lián)系或其代謝的結(jié)果,對(duì)維持細(xì)胞的正?；顒?dòng)具有重要作用,當(dāng)有外來物理、化學(xué)因素作用時(shí),則可誘導(dǎo)出過量的DPC。DPC與其他DNA損傷相比,較難修復(fù),且DPC僅可發(fā)生在單鏈DNA上,這表明這種交聯(lián)只能發(fā)生在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄期間,因此DPC的形成,必將對(duì)DNA的構(gòu)象和功能(復(fù)制與轉(zhuǎn)錄)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,并在其復(fù)制過程中容易造成某些重要基因(如抑癌基因)的丟失,導(dǎo)致腫瘤或某些嚴(yán)重疾病的發(fā)生?？梢奃PC過度增加是一種病理現(xiàn)象,是DNA分子的一種嚴(yán)重的遺傳損傷。3.1聚合酶sds-kci沉淀法DPC常用的檢測(cè)方法有:堿洗提法、濾膜結(jié)合法、梯度離心法和SDS-KCI沉淀法,近年來又發(fā)展了許多敏感和特異的方法如:免疫印跡法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)法、氨基酸前標(biāo)記法以及125I-后標(biāo)記法等。本實(shí)驗(yàn)室主要采用SDS-KCI沉淀法,此方法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果合理,其主要原理是:SDS可以和DPC以及其他的蛋白結(jié)合,而不和自由的DNA結(jié)合,再向樣品中加入KCl溶液可使DPC和蛋白質(zhì)沉淀下來,而自由的DNA留在上清液中。將上清液轉(zhuǎn)移后,再向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白質(zhì),使DPC中的DNA游離出來,并用熒光法測(cè)定DNA的含量以及原液中DNA的含量,進(jìn)而得出DNA和蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度。3.2dpc和dna交叉融合的可能路徑DPC是一種穩(wěn)定的共價(jià)化合物,難以被一般的分離劑如堿性溶液、去污劑、強(qiáng)變性劑以及有機(jī)提取劑等分開。DPC的生化特性有:(1)在正常細(xì)胞中存在著一定量的DPC,這是DNA與核蛋白的正常聯(lián)系或代謝結(jié)果。當(dāng)DNA和蛋白質(zhì)受到外來理化因素如:UV,γ-射線、烷化劑、甲醛以及一些金屬化合物如鎳和鉻等直接和間接的作用,則可誘導(dǎo)出超量的交聯(lián)產(chǎn)物。(2)和DNA相聯(lián)系的蛋白質(zhì)。與DNA交聯(lián)的有正常聯(lián)系的蛋白質(zhì),如核小體質(zhì)粒組蛋白等,也有與DNA無接觸的蛋白質(zhì),如白蛋白或溶菌酶等。紫外光可誘導(dǎo)小牛血清白蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、氨基酰tRNA合成酶以及核蛋白與核酸交聯(lián)。(3)DPC的DNA序列:通過核酸探針雜交技術(shù),可對(duì)DPC的DNA序列進(jìn)行探討。另外DPC可在染色體結(jié)構(gòu)松散的基因組區(qū)域優(yōu)先形成,而這些基因正是鄰近于核基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)并具有轉(zhuǎn)錄活性的序列。3.3dpc的檢測(cè)甲醛具有廣泛的遺傳毒性,可以導(dǎo)致DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián),DNA-DNA交聯(lián),DNA鏈斷裂,染色體的畸變,姐妹染色體的交換等,其主要和直接的遺傳毒性效應(yīng)就是形成DPC。1989年Casanove等的實(shí)驗(yàn)表明,用氣態(tài)(14C)-甲醛暴露6h,以放射性“標(biāo)記指數(shù)(labelingindex,LI)”為指標(biāo),檢測(cè)F344大鼠鼻腔粘膜中DPC的水平,結(jié)果如下:經(jīng)0.3ppm水平暴露,即可檢出DPC的形成;經(jīng)0.7,2,6,10ppm水平暴露,DPC形成的數(shù)值分別增長(zhǎng)為0.5,4.2,17,24LI。另外也發(fā)現(xiàn),在研究甲醛對(duì)人血淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)甲醛濃度在0.005mmol/L和0.025mmol/L時(shí),DPC的含量和對(duì)照組(加入蒸餾水)相比沒有顯著性的差異(P>0.05),當(dāng)甲醛濃度為0.125mmol/L和0.625mmol/L時(shí),DPC的含量和對(duì)照組相比有極顯著性的差異(P<0.01),結(jié)果反映:甲醛在低濃度時(shí),DNA-蛋白質(zhì)的交聯(lián)現(xiàn)象不明顯或者不引起DNA-蛋白質(zhì)的交聯(lián)現(xiàn)象;在高濃度時(shí),甲醛能顯著地誘導(dǎo)DPC的產(chǎn)生。3.4甲醛對(duì)組蛋白的抗氧化作用(1)甲醛是醛類化合物中最簡(jiǎn)單的小分子,其毒性效應(yīng)的一個(gè)重要方面是源于它的羰基親電性和較小的空間位阻,使其易于與核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。在體內(nèi)或體外甲醛先與蛋白質(zhì)或核酸上的自由的氨基反應(yīng)生成不穩(wěn)定的羥甲基加合物,然后再進(jìn)一步與核酸或蛋白質(zhì)反應(yīng)形成穩(wěn)定的交聯(lián)物。甲醛主要引起DNA和組蛋白的交聯(lián),該過程是甲醛先快速的和組蛋白反應(yīng),然后再和DNA環(huán)外的氨基結(jié)合形成DPC,主要涉及到組蛋白賴氨酸的ε-氨基和A/G堿基的環(huán)外氨基,其主要結(jié)構(gòu)為:histone-NH-CH2-NH-DNA。(2)甲醛損害生物體抗氧化系統(tǒng)或作為抗氧化酶的抑制劑,間接導(dǎo)致DPC的增加。例如甲醛可以引起還原性GSH的耗竭,抑制谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性,使羥自由基和氧自由基清除不力,導(dǎo)致DPC含量的增加。3.5dpc酶的降解和修復(fù)與其他生物體存在的各種DNA損傷的修復(fù)機(jī)制相比,DPC的修復(fù)存在兩個(gè)特點(diǎn):(1)修復(fù)困難;(2)人類對(duì)DPC的修復(fù)機(jī)制知之甚少。初步研究結(jié)果表明,DPC的修復(fù)可能涉及“DPC的水解”和“短肽-DNA的修復(fù)”兩個(gè)基本過程:(1)DPC水解的機(jī)制有:自發(fā)性水解(慢)和酶催化水解(快)。QuievrynG等認(rèn)為蛋白酶復(fù)合體proteasome具有對(duì)DPC酶催化水解的功能,2000年他們采用proteasome的特異性抑制劑lactacystin(10μM)作用DPC模型細(xì)胞,使DPC水解的速度降低3倍。(2)短肽-DNA修復(fù)機(jī)制:DPC水解之后,還有短肽或氨基酸殘基繼續(xù)與DNA相聯(lián),這時(shí)需要DPC修復(fù)酶來切除這些成份。例如,一種新近命名為TDP1的磷酸二酯酶就具有切除與DNA相聯(lián)的酪氨酸殘基或短肽的功能,這是目前唯一被報(bào)道的DPC修復(fù)酶,但是該酶僅能切除與DNA相聯(lián)的酪氨酸殘基或短肽。由于甲醛主要引起DNA和組蛋白交聯(lián)而形成的DPC,所以我們要尋找的是能切除與DNA相聯(lián)的賴氨酸殘基或短肽的DPC修復(fù)酶,或稱之為“賴氨酸DPC修復(fù)酶”。4甲醛污染嚴(yán)重,危害人類健康因?yàn)榧兹┰诠I(yè)、建筑業(yè)及醫(yī)學(xué)等多種行業(yè)廣泛應(yīng)用,特別是近10年來,隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,人民生活水平的提高,室內(nèi)裝修已經(jīng)成