膠原海綿的生物相容性和降解

膠原海綿的生物相容性和降解

0凝血酶抑制劑的應(yīng)用蛋白質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，相對(duì)分子量約為300萬噸。它是所含的最廣泛的功能蛋白質(zhì)，占蛋白質(zhì)總數(shù)的25.30%。膠原作為一種纖維狀蛋白,自身即為優(yōu)良的組織工程支架材料,是最早被利用的生物材料之一,擁有特殊的三股肽鏈螺旋結(jié)構(gòu),具有可降解性、生物相容性和止血性等許多優(yōu)良的生物學(xué)特性,近些年在創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,并形成多種產(chǎn)品形式。其中膠原蛋白海綿是由膠原溶液經(jīng)凍干形成,是基于膠原生物材料的一種主要產(chǎn)品形式,已被廣泛應(yīng)用于各種創(chuàng)面止血,組織殘腔的填充修復(fù)。張安美將凝血酶與膠原蛋白海綿聯(lián)合用于手術(shù)創(chuàng)面,發(fā)現(xiàn)其有較好的止血作用和安全性。另外,也有很多報(bào)道將人肌腱、牛肌腱、鼠尾、豬皮等制備的膠原蛋白海綿用于臨床治療,其良好的功能和特性,以及易于加工、滅菌和保存等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),被視為非常有前景的生物材料之一,具有廣泛的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值。張立彥等通過考察形貌及理化特征優(yōu)化了殼聚糖/膠原蛋白復(fù)合海綿性能,使其抗張強(qiáng)度為85MPa、斷裂伸長(zhǎng)率為4.87%、吸水率為200%、孔隙率為78.8%,采用掃描電鏡檢測(cè)復(fù)合海綿孔徑大小為100-150μm。王秋卓以牛跟腱為原材料,分析了海綿狀膠原蛋白纖維均勻度、抗原性、色澤及纖維細(xì)度等性狀,并觀察了產(chǎn)品的純度和膠原纖維結(jié)構(gòu)。汪海嬰等采用差式掃描量熱儀、體外模擬膠原蛋白酶降解、材料拉伸性能分析及NIH/3T3細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了魚皮酸溶性膠原海綿,魚皮酶溶性膠原海綿和豬皮酶溶性膠原海綿的材料熱穩(wěn)定性、降解性、生物相容性和材料機(jī)械力學(xué)性能。對(duì)生物材料相容性研究有很多方法,其中常用的有體內(nèi)直接植入法和體外復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)法兩種。馬忠仁等將新生牛皮膠原蛋白海綿與黑裘皮羔羊腎成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)海綿具有良好的生物相容性。方成等將魚皮酸溶性膠原蛋白、魚皮酶溶性膠原蛋白、豬皮酶溶性膠原蛋白植入SD大鼠,評(píng)價(jià)細(xì)胞附著、免疫原性及致炎性等,結(jié)果表明魚皮酶溶性膠原海綿具有組織相容性優(yōu)勢(shì)。Ueda等利用膠原海綿結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1植入促進(jìn)兔顱骨缺損骨修復(fù),結(jié)果顯示海綿表現(xiàn)出良好的生物相容性和促修復(fù)作用。本實(shí)驗(yàn)選擇牛源膠原蛋白海綿為研究對(duì)象,評(píng)價(jià)其微觀結(jié)構(gòu)、變性溫度、降解性能、生物相容性等生物性能,評(píng)估牛源活性膠原蛋白海綿在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。1膠原蛋白海綿的檢測(cè)設(shè)計(jì):材料特性及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察。時(shí)間及地點(diǎn):實(shí)驗(yàn)于2012年4至7月在暨南大學(xué)和廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。材料:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:11至12周齡普通級(jí)新西蘭兔24只,雌雄不拘,體質(zhì)量1.8-2.2kg,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):0104935,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施合格證號(hào):0062307。藥物及試劑:膠原蛋白海綿(廣州創(chuàng)爾生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào)20110404);水合氯醛(上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)五聯(lián)化工廠,批號(hào):20050620);安爾碘(上海利康消毒高科技有限公司,批號(hào):20120216)。實(shí)驗(yàn)方法:膠原蛋白海綿的形貌與熱穩(wěn)定性研究:掃描電鏡分析膠原蛋白海綿的形貌:通過掃描電鏡觀察膠原蛋白海綿的孔徑及纖維結(jié)構(gòu)。用D-Hank’s液小心洗滌樣品,以2%戊二醛和1%鋨酸4℃固定,乙醇梯度脫水,臨界點(diǎn)干燥,離子濺射儀噴金,掃描電鏡觀察。透射電鏡分析膠原的微觀結(jié)構(gòu):取一定量的膠原蛋白海綿,溶于0.1mol/L醋酸溶液,配制成膠原溶液,取少許膠原溶液,采用負(fù)染法制備電鏡樣品,pH7.4條件下的1%磷鎢酸染色1min,自然風(fēng)干,于PhilipsTecnai10透射電鏡下觀察其形態(tài)。圓二色譜分析膠原的二級(jí)結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性:準(zhǔn)確稱取一定量膠原蛋白海綿,溶于0.1mol/L醋酸溶液,配制成質(zhì)量濃度為0.5g/L的蛋白溶液。將溶液樣品加入1mm光徑的石英池,在180-260nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,記錄結(jié)果為3次掃描的平均值。以凍干成海綿前的膠原溶液作為對(duì)照組。變溫掃描選取[θ]220nm處進(jìn)行,取膠原溶液、膠原蛋白海綿配置的蛋白溶液樣品分別加入1mm光徑的石英池,溫度區(qū)間設(shè)置為15-60℃,升溫速率為1℃/min。植入后材料的降解、吸收及組織相容性研究:動(dòng)物模型建立:將所選兔隨機(jī)均分為兩組,其中實(shí)驗(yàn)組兔在脊柱兩側(cè)約2cm處等距離各選2個(gè)植入點(diǎn),每點(diǎn)間隔2cm,左右兩側(cè)各2個(gè)點(diǎn)植入膠原蛋白海綿。手術(shù)切開皮膚,分離皮下組織和筋膜,以止血鉗分離植入點(diǎn)肌肉,將膠原蛋白海綿植入深度為1.0-2.0cm的肌肉內(nèi),縫合肌肉及皮膚;空白對(duì)照組手術(shù)切開皮膚,分離皮下組織和筋膜,以止血鉗分離植入點(diǎn)肌肉,然后縫合肌肉及皮膚。實(shí)驗(yàn)后連續(xù)3d每只注射20×104U/d的青霉素,以防感染。術(shù)后觀察創(chuàng)面愈合情況,術(shù)后2,4,8,12周每次取材3只。膠原蛋白海綿動(dòng)物體內(nèi)降解、吸收的組織病理觀察:所有兔單籠喂養(yǎng),術(shù)后觀察記錄傷口愈合情況。分別于術(shù)后2,4,8,12周處死新西蘭兔,取出脊柱兩側(cè)肌肉,觀察海綿植入后不同時(shí)期的降解率。取包裹試樣周圍0.5-1.0cm的肌肉組織,體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定,蘇木精-伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察炎癥反應(yīng)(分級(jí))、細(xì)胞種類數(shù)量特征、包囊形成情況。主要觀察指標(biāo):膠原蛋白海綿的生物特性及體內(nèi)降解吸收。2結(jié)果的結(jié)果2.1動(dòng)物的數(shù)量分析2.3膠原蛋白海綿的吸收峰分析膠原由3條α肽鏈組成,α肽鏈自身為α螺旋結(jié)構(gòu),3條α肽鏈則以平行、右手螺旋形式纏繞成“草繩狀”三股螺旋結(jié)構(gòu)。采用圓二色譜法測(cè)定膠原溶液、膠原蛋白海綿二級(jí)結(jié)構(gòu)特征,結(jié)果顯示兩者圖譜具有非常好的重疊性(圖1C),均在220nm有一強(qiáng)的正特征吸收峰,206nm左右有一強(qiáng)負(fù)特征吸收峰,具有典型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收性質(zhì),說明在膠原溶液凍干成海綿過程中膠原構(gòu)象并未發(fā)生變化。對(duì)圓二色譜所測(cè)數(shù)據(jù)采用Cdpro軟件分析膠原蛋白海綿中不同二級(jí)結(jié)構(gòu)所占的比例,其中α螺旋含量為34.4%,β折疊為33%,β轉(zhuǎn)角為16.8%,無規(guī)卷曲為16.4%。與對(duì)照組膠原溶液一致。圓二色譜同時(shí)可以反映膠原溶液與膠原蛋白海綿的變性溫度,當(dāng)膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被完全破壞時(shí),正峰會(huì)完全消失。如圖2所示,以220nm處吸收峰的變化為例說明,縱坐標(biāo)反映二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋構(gòu)象的變化情況,顯示膠原溶液在33℃之后正吸收峰值開始降低,構(gòu)象遭到破壞,隨著溫度進(jìn)一步升高,當(dāng)溫度達(dá)到50℃左右,蛋白變性達(dá)到最大程度;膠原蛋白海綿在30℃左右正吸收峰值開始降低,隨著溫度升高到達(dá)48℃構(gòu)象完全遭到破壞,二者變性溫度基本一致。2.4各時(shí)間點(diǎn)海綿降解率及病理組織分析實(shí)驗(yàn)組術(shù)后2周傷口痊愈,未出現(xiàn)出血、紅腫、壞死和試樣排出等異?，F(xiàn)象,海綿的降解率為0。術(shù)后第2,4,8,12周取材,第4周可見到膠原蛋白海綿,海綿的降解率為0,第8周海綿的降解率為33%,至12周海綿降解率達(dá)75%(圖3)。病理組織切片分析顯示,第2周植入部位有明顯異物反應(yīng),可見較多單核細(xì)胞及少量異物巨細(xì)胞浸潤,組織炎癥反應(yīng)小于Ⅲ級(jí)(圖4A);第4周植入部位可見較多增生結(jié)締組織,其中散在單核細(xì)胞浸潤,未見異物巨細(xì)胞,炎癥反應(yīng)小于Ⅰ級(jí),且未見明顯纖維囊結(jié)構(gòu)(圖4B);術(shù)后第8周,植入部位可見較多纖維結(jié)締組織增生并發(fā)生玻璃樣變,散在單核細(xì)胞浸潤,未見異物巨細(xì)胞(圖4C);隨著植入時(shí)間達(dá)12周,植入部位未見單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及異物巨細(xì)胞浸潤,炎癥反應(yīng)逐漸消失,可見脂肪細(xì)胞,且有結(jié)締組織增生(圖4D)?？瞻讓?duì)照組在實(shí)驗(yàn)過程中均未出現(xiàn)異物反應(yīng)(圖4E)。3差示量熱掃描分析及圓二色譜分析在形貌特征方面,作為組織工程使用的支架,膠原蛋白海綿其疏松多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞黏附,本實(shí)驗(yàn)制備的海綿具有疏松多孔結(jié)構(gòu),孔徑平均為100μm,孔隙率約95.8%,多孔結(jié)構(gòu)均一、致密。與文獻(xiàn)報(bào)道的優(yōu)化海綿的孔徑基本一致,但孔隙率占優(yōu)勢(shì)。膠原蛋白的生物活性依賴于其三級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性,本實(shí)驗(yàn)通過電鏡觀察和圓二色譜分析其三級(jí)結(jié)構(gòu),驗(yàn)證膠原蛋白海綿的生物活性。與大量文獻(xiàn)報(bào)道一致,電鏡下觀察到膠原具有的特殊的周期性橫紋區(qū)帶。圓二色譜是測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的一種快速、簡(jiǎn)單方法,還可以用于研究蛋白質(zhì)受溫度影響時(shí)構(gòu)象的變化情況。本實(shí)驗(yàn)通過將膠原蛋白海綿溶解獲得的膠原蛋白溶液進(jìn)行圓二色譜分析,發(fā)現(xiàn)在220nm附近出現(xiàn)正峰,202nm左右出現(xiàn)負(fù)峰。與大量文獻(xiàn)報(bào)道的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原蛋白圓二色特征吸收峰相一致,說明膠原蛋白經(jīng)凍干工藝形成海綿的過程中,其二三級(jí)結(jié)構(gòu)仍保持完整,具有良好的生物活性。熱變性溫度是反映膠原蛋白天然螺旋結(jié)構(gòu)完整性的一項(xiàng)重要指標(biāo),當(dāng)體系溫度達(dá)到變性溫度Td時(shí),膠原分子從伸展的纖維狀轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲狀。差示量熱掃描分析及圓二色譜分析是研究熱變性溫度的常見方法。有研究表明利用圓二色譜分析正峰強(qiáng)度的變化,在一定程度上能夠反映膠原蛋白結(jié)構(gòu)的變化,當(dāng)膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被完全破壞時(shí),220nm的正峰會(huì)完全消失。本實(shí)驗(yàn)通過圓二色譜分析膠原溶液220nm的正峰變化,當(dāng)溫度升至35℃以上,膠原的圓二色性發(fā)生強(qiáng)烈改變,正峰強(qiáng)度急劇減小,膠原蛋白三股螺旋立體結(jié)構(gòu)被破壞,膠原蛋白發(fā)生變性,與文獻(xiàn)報(bào)道差示量熱掃描分析測(cè)定的牛源、魚源膠原蛋白變性溫度基本一致。膠原蛋白海綿屬于天然可降解生物活性材料。本實(shí)驗(yàn)通過體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證膠原蛋白海綿生物相容性,植入初期在植入部位有少量炎性細(xì)胞聚集,局部組織出現(xiàn)異物反應(yīng),這屬于機(jī)體對(duì)異物的正常反應(yīng);隨著創(chuàng)面的愈合,植入部位的炎性細(xì)胞逐漸減少,周圍結(jié)締組織增生明顯,炎癥反應(yīng)逐漸消失。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),肌肉植入第4-8周降解比較顯著,到第12周材料可見率低于25%,在整個(gè)材料植入和降解周期內(nèi)無明顯纖維囊結(jié)構(gòu)形成,植入部位未見組織壞死情況發(fā)生,植入機(jī)體后除輕微和短時(shí)的炎癥反應(yīng)外,未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng),材料與組織的生物相容性良好。這與Anselme等將膠原海綿皮下植入的組織反應(yīng)、超微結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)研究、降解周期(3個(gè)月)相一致?；谀z原蛋白海綿良好的生物相容性和可降解性,大量研究及應(yīng)用以膠原基生物材料,結(jié)合細(xì)胞種植或添加其他活性物質(zhì)如慶大霉素、生長(zhǎng)因子等,進(jìn)一步拓展了其應(yīng)用范圍,因此膠原蛋白海綿將在生物材料領(lǐng)域發(fā)揮其重要的潛在價(jià)值。文章亮點(diǎn):1膠原蛋白海綿是由膠原溶液經(jīng)凍干形成,是基于膠原生物材料的一種主要產(chǎn)品形式,已被廣泛應(yīng)用于各種創(chuàng)面止血,組織殘腔的填充修復(fù)。2實(shí)驗(yàn)首次系統(tǒng)地表征膠原蛋白海綿材料的生物特性,包括孔徑、孔隙率、電鏡結(jié)構(gòu)、二級(jí)構(gòu)象及熱穩(wěn)定性,并通過動(dòng)物體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了膠原蛋白海綿的生物相容性及降解吸收特性。遲妍妍,樂堯金,劉旭昭,李琪,雷靜,湯順清.膠原蛋白海綿的生物特性及體內(nèi)降解吸收[J].中國組織工程研究,2014,18(34):5515-5519.ChiYY,LeYJ,LiuXZ,LiQ,LeiJ,TangSQ.Biologicalproperties,degradationandabsorptionofcollagenspongesinvivo.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2014;18(34):5515-5519.24只新西蘭兔均進(jìn)入結(jié)果分析。掃描電鏡分析經(jīng)測(cè)定膠原蛋白海綿孔徑分布為40-150μm,平均100μm,孔壁1μm左右,孔隙率約95.8%,呈纖維細(xì)絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),見圖1A。圖1B顯示的是膠原蛋白海綿的透射電鏡圖,膠原纖維呈現(xiàn)分散態(tài),纖維直徑200-300nm,可觀察到膠原具有的特殊的周期性橫紋區(qū)帶。2.2實(shí)驗(yàn)材料及倫理要求作者貢獻(xiàn):湯順清對(duì)實(shí)驗(yàn)的總體構(gòu)思和布局提供指導(dǎo),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分及文章部分撰寫由遲妍妍負(fù)責(zé),樂堯金完成膠原蛋白海綿生物表征部分(電鏡結(jié)構(gòu)、二級(jí)構(gòu)象、熱穩(wěn)定性)并完成文章內(nèi)容的部分撰寫,劉旭昭參