folin-ulecileu比色法測定總多酚含量

folin-ulecileu比色法測定總多酚含量

植物多酚是自然界抗氧化物中的一種重要藥物。它是水果、蔬菜、飲料、茶、紅軍和咖啡的主要來源。植物多酚具有很強(qiáng)的抗氧化和清除自由基活性,多應(yīng)用于預(yù)防與治療癌癥、中風(fēng)、冠心病和神經(jīng)退行性疾病,同時它也是一類抗?fàn)I養(yǎng)素物質(zhì),會阻礙膳食非血紅素鐵、鈣等微量元素的吸收,可見植物多酚對人體健康的影響主要決定于其來源食材中多酚的含量與食物攝入量。目前,國內(nèi)關(guān)于食材中總多酚含量的報道很少,總多酚定量分析缺乏統(tǒng)一的方法,本研究選用了國內(nèi)外文獻(xiàn)報道中應(yīng)用較多的Folin-Ciocalteu比色法,然而關(guān)于FolinCiocalteu法條件的研究較少,并且文獻(xiàn)中采用的比色條件差異較大[11,12,13,14,15,16,17,18],如所用堿液的濃度、用量差異很大,顯色時間從30min到150min不等,因此,本研究對樣品中總多酚的浸提方法和影響含量測定結(jié)果的反應(yīng)條件逐一進(jìn)行觀察,確定最佳反應(yīng)體系,并在系統(tǒng)的方法學(xué)評價基礎(chǔ)上,應(yīng)用該法對收集于河南省南陽市的26種蔬菜和水果樣品進(jìn)行了總多酚的定量測定。1材料和方法1.1試劑與儀器方法樣品:辣椒(青、尖)、黃瓜(夏)、番茄(西紅柿)、馬鈴薯、甘薯(紅)、四季豆、豇豆、黃豆芽、芹菜(莖、葉)、韭菜、生菜、蒜苗、西葫蘆、包心菜(綠)、大白菜(白口)、茄子(紫皮、圓)、苤藍(lán)(白)、白蘿卜(長)、胡蘿卜、洋蔥(紫皮)、大蔥、大蒜(白皮)、蘋果1(青香蕉)、梨(鴨梨)、香蕉、香瓜,產(chǎn)地河南省南陽市高廟鄉(xiāng)。蘋果2(紅福士,購自南陽市市場)。試劑:沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,購自Sigma-Aldrich公司)、鎢酸鈉、鉬酸鈉、濃磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、溴水、碳酸鈉、丙酮均為國產(chǎn)分析純試劑。Folin-Ciocalteu試劑(下文簡稱FC試劑):于1000ml磨口回流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉50g,鉬酸鈉12.5g,蒸餾水350ml,濃磷酸(14mol/L)25ml,濃鹽酸(12mol/L)50ml,充分混勻,微沸回流10h,稱取一水合硫酸鋰(Li2SO4·H2O)87.29g,少量多次加入到圓底燒瓶內(nèi),滴加溴水?dāng)?shù)滴,開口沸騰,使溴水完全揮發(fā)為止,冷卻,定容至500ml,過濾,置棕色瓶中保存?zhèn)溆?使用時用1倍蒸餾水稀釋。儀器:7230G型可見分光光度計(上海菁華科技儀器公司);K-Q-500B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器公司);101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);FA2104型電子分析天平(上海恒平科學(xué)公司)。1.2方法1.2.1總多酚含量的測定在含有酚類物質(zhì)的待測試樣中加入一定量的FC試劑和一定量的10%碳酸鈉溶液,定容至25ml,在一定溫度下避光反應(yīng)一定時間,以蒸餾水為空白,測定試樣液體的吸光度值(absorbency,A),依據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的擬合方程,計算試樣中的總多酚含量。1.2.2fc對碳酸鈉穩(wěn)定性的影響精確稱取20mg干燥沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品2份,分別以蒸餾水和80%丙酮為溶劑,30℃超聲至完全溶解后定容至100ml,配制成0.2mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液,吸取1ml分別加入FC試劑2ml,10%碳酸鈉溶液10ml,定容至25ml,40℃避光反應(yīng)1.5h,以蒸餾水為空白,分別于730、760、765nm處測定吸光度值。1.2.3fc試劑用量的確定(1)顯色溫度的確定:以1.2.2試驗(yàn)結(jié)果確定的溶劑配制0.2mg/ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,取6份,每份1ml,按照1.2.1所述試驗(yàn)方法,固定其他試驗(yàn)條件(FC試劑2ml,10%碳酸鈉溶液10ml,避光反應(yīng)1.5h),分別在20、30、40、50、60、70℃下反應(yīng),于1.2.2試驗(yàn)結(jié)果確定的波長處測定吸光度值,以比較不同反應(yīng)溫度對吸光度的影響。(2)顯色時間的確定:同上取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液6份,每份1ml,按照1.2.1所述試驗(yàn)方法,固定其他試驗(yàn)條件(FC試劑2ml,10%碳酸鈉溶液10ml,40℃,避光),分別反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h,于1.2.2試驗(yàn)結(jié)果確定的波長處測定吸光度值,以比較不同顯色時間對吸光度的影響。(3)FC試劑用量的確定:同上取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液6份,每份1ml,按照1.2.1所述試驗(yàn)方法,固定其他試驗(yàn)條件(10%碳酸鈉溶液10ml,于40℃避光反應(yīng)1.5h),分別加入FC試劑0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml,于1.2.2試驗(yàn)結(jié)果確定的波長處測定吸光度值,以比較FC試劑用量對吸光度的影響。(4)10%碳酸鈉溶液用量的確定:同上取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液6份,每份1ml,按照1.2.1所述試驗(yàn)方法,固定其他試驗(yàn)條件(FC試劑2ml,40℃避光反應(yīng)1.5h),分別加入10%碳酸鈉溶液1、2、4、6、8、10ml,于1.2.2試驗(yàn)結(jié)果確定的波長處測定吸光度值以比較10%碳酸鈉溶液用量對吸光度的影響。1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取0.2mg/ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml,按照1.2.3試驗(yàn)結(jié)果確定的最佳反應(yīng)條件加入FC試劑和10%碳酸鈉溶液,以蒸餾水定容至25ml,避光反應(yīng)后,以蒸餾水為空白,于1.2.2試驗(yàn)結(jié)果確定的波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.5超聲提取法稱取蘋果樣品可食部100g,加入蒸餾水100ml,制為勻漿。稱取該勻漿12份,各10g,其中3份以蒸餾水定容,3份加入不等量的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后以蒸餾水定容,3份以50%丙酮溶液定容,3份加入不等量的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后以50%丙酮溶液定容至100ml,30℃超聲提取30min,過濾。分別取濾液1ml,按照1.2.1試驗(yàn)方法和1.2.3試驗(yàn)結(jié)果確定的最佳反應(yīng)條件于1.2.2試驗(yàn)結(jié)果確定的波長處測定吸光度值。1.2.6方法的重復(fù)性試驗(yàn)(1)重復(fù)性試驗(yàn):從一批蘋果樣品中隨機(jī)抽取6個,分別取可食部100g,加入蒸餾水100ml,制為勻漿,取勻漿10ml,按照1.2.5試驗(yàn)結(jié)果確定的方法提取蘋果總多酚,按照1.2.1試驗(yàn)方法和1.2.3試驗(yàn)結(jié)果確定的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行顯色反應(yīng),于1.2.2試驗(yàn)結(jié)果確定的波長處測定吸光度值,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),以評價該方法的重復(fù)性。(2)精密度試驗(yàn):按上述樣品前處理、總多酚制備和測定方法對同一蘋果待測樣品平行測定6次,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,以評價該方法的精密度。(3)穩(wěn)定性試驗(yàn):取蘋果待測樣品1份,按照上述總多酚制備和測定方法,分別在工作液顯色完全后的10、20、30、40、50、60min測定吸光度值,計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,以評價該方法的穩(wěn)定性。(4)加標(biāo)回收率試驗(yàn):向已知總多酚含量的蘋果待測樣品中分別加入300、500、700μl的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定并計算總多酚的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,以評價該方法的準(zhǔn)確性和可靠性。1.2.7單因素法提取樣品中總多酚含量的確定取待測蔬菜和水果樣品(每種取2份平行)可食部100g,加入蒸餾水100ml,制備勻漿后稱取10g,按照1.2.5試驗(yàn)中確定的提取方法制備樣品總多酚后吸取濾液1ml,按照1.2.1試驗(yàn)方法和1.2.3試驗(yàn)結(jié)果確定的反應(yīng)條件進(jìn)行顯色反應(yīng),于1.2.2試驗(yàn)結(jié)果確定的波長處測定吸光度值并計算樣品中總酚含量。2結(jié)果2.1溶劑的選擇表1顯示,采用不同溶劑溶解沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品對顯色的影響差異不大。因此選擇蒸餾水為溶劑。兩種溶解體系中的標(biāo)準(zhǔn)溶液在文獻(xiàn)報道的3種波長下吸光度值略有不同,但對應(yīng)趨勢一致,因此選擇顯色效果最好的765nm為本試驗(yàn)體系的檢測波長。2.2反應(yīng)條件的確定Folin-Ciocalteu顯色體系中采用不同反應(yīng)條件對終反應(yīng)液的比色效果會產(chǎn)生影響(表2)。其中顯色溫度、顯色時間和10%碳酸鈉溶液用量影響較大。隨著設(shè)定溫度的升高,反應(yīng)液的顏色逐漸加深,在50℃、60℃條件下吸光度值陡增且趨于穩(wěn)定;反應(yīng)液的吸光度值在反應(yīng)時間為1h時達(dá)到峰值,繼續(xù)增加反應(yīng)時間顏色逐漸變淺;FC試劑與酚類化合物反應(yīng)后必須在堿性環(huán)境下才能顯色,因此碳酸鈉溶液的用量影響了反應(yīng)液的顯色效果,考察結(jié)果顯示,當(dāng)加入10ml10%碳酸鈉溶液時,吸光度值發(fā)生了較大變化,可見10%碳酸鈉溶液與FC試劑的用量比為5:1是適宜的。綜合考量工作液吸光度值的大小、穩(wěn)定性、操作的簡便易行及試驗(yàn)成本確定了本試驗(yàn)體系的反應(yīng)條件:顯色溫度:50℃;顯色時間:60min;FC顯色劑用量:2ml;10%碳酸鈉溶液用量:10ml。2.3利用線圖1以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),反應(yīng)液的吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,見圖1。擬合回歸方程y=0.0149+4.1023x,相關(guān)系數(shù)R2為0.9987,表明沒食子酸在質(zhì)量濃度為0~0.20mg/ml范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系,符合朗伯比爾定律,該方程可用于蔬菜樣品總多酚的定量測定。2.4提取溶劑的選擇超聲波浸提法提取植物多酚常用浸提溶劑有蒸餾水、甲醇、丙酮和乙醇,參考文獻(xiàn),選取了蒸餾水和50%丙酮溶液觀察溶劑對浸提效果的影響。由表3結(jié)果可以看出,兩種溶劑浸提多酚的回收率都比較高,差異不大,說明選擇超聲波浸提法以及浸提參數(shù)的設(shè)置是合理的。但表4結(jié)果表明采用50%丙酮溶液為浸提溶劑,顯色更加靈敏而穩(wěn)定,提取率顯著高于蒸餾水,所以確定50%丙酮溶液為樣品中總多酚的浸提溶劑。2.5calteu比色法的穩(wěn)定性按照本研究確定的最佳提取方法和最適反應(yīng)條件建立的Folin-Ciocalteu比色法的重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表5,6,數(shù)據(jù)表明,在本實(shí)驗(yàn)室條件下,該比色方法顯色靈敏,準(zhǔn)確可靠,可重復(fù)性較好,穩(wěn)定性很高,完全適用于對待測蔬菜樣品進(jìn)行總多酚的定量測定。2.6河南當(dāng)?shù)夭煌N類蔬菜和水果總多酚含量的比較表7列出了應(yīng)用Folin-Ciocalteu法在最適反應(yīng)條件下測定的26種河南當(dāng)?shù)爻Ｒ娛卟撕退麡悠返目偠喾雍拷Y(jié)果,可以看出鮮豆類(如豇豆、豆芽)和蔥蒜類食材總多酚含量相對較高,茄瓜類和嫩莖、葉類蔬菜多酚含量較低。水果中屬蘋果和香瓜多酚含量豐富。3最佳反應(yīng)條件的確定及對數(shù)據(jù)重復(fù)保護(hù)的意義對食物中酚類化合物總量進(jìn)行測定,國內(nèi)外常用高錳酸鉀滴定法和各種光譜學(xué)方法,如酒石酸亞鐵分光光度法、鐵氰化鉀分光光度法、香草醛法、原子吸收光譜法、化學(xué)發(fā)光法等。Folin-Ciocalteu比色法是基于FolinCiocalteu試劑-多酚顯色反應(yīng)的可見光分光光度法,其原理是Folin-Ciocalte試劑中的鎢鉬酸將多酚化合物定量氧化,自身被還原(W6+變?yōu)閃5+)生成藍(lán)色的化合物,反應(yīng)液顏色的深淺跟多酚含量呈正相關(guān)。由于國內(nèi)外研究中所選擇的反應(yīng)條件差異較大[3,14,15,16,17,18],本研究對影響多酚浸提效果和顯色效果的因素逐個進(jìn)行考察和優(yōu)化,確定出本實(shí)驗(yàn)建立的最適測定體系,與其他文獻(xiàn)報道的最佳反應(yīng)條件相比也存在差異,認(rèn)為這與檢測環(huán)境、實(shí)驗(yàn)儀器、樣品采摘時間、成熟度、樣品中酚類化合物的種類和結(jié)構(gòu)均有關(guān)。受現(xiàn)場工作安排和條件限制,最適反應(yīng)條件優(yōu)選未能用正交設(shè)計,只進(jìn)行單因素多水平逐一考察,是本研究的缺陷。系統(tǒng)的方法學(xué)評價結(jié)果顯示,按最適反應(yīng)條件建立Folin-Ciocalteu比色法測定多酚含量結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可多次重復(fù),平均回收率為102.12%,批內(nèi)重復(fù)測量精密度良好,顯色完全后穩(wěn)定性極好。將本次結(jié)果與使用Folin-Ciocalteu比色法測定蔬菜多酚的其他文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)進(jìn)行對比,本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與國內(nèi)研究結(jié)果偏差小,與國外報道數(shù)據(jù)吻合度相對差一些。由于