CD4 T淋巴細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)檢測

粒細(xì)胞分類淋巴細(xì)胞為CD45強(qiáng)陽性，顆粒度較低的一群細(xì)胞1淋巴細(xì)胞分群B淋巴細(xì)胞CD19+T淋巴細(xì)胞CD3+T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞CD3+CD4+淋巴細(xì)胞（CD45+）NK細(xì)胞CD3-CD16+56+T抑制/細(xì)胞毒性細(xì)胞CD3+CD8+2淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答中起核心作用。CD4+T淋巴細(xì)胞對細(xì)胞免疫和體液免疫平衡的維持具有樞紐的功能。CD4+T淋巴細(xì)胞是HIV感染最主要的靶細(xì)胞。3HIV及其包膜蛋白的直接細(xì)胞致病作用感染細(xì)胞-未感染細(xì)胞形成合胞體程序性細(xì)胞死亡自身免疫機(jī)制特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞對HIV感染細(xì)胞的破壞作用HIV通過多種直接和間接的病理機(jī)制導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞數(shù)量的缺失，最終引起感染者免疫功能缺陷。

4HIV感染后CD4+、CD8+T細(xì)胞變化CD4+T細(xì)胞（Th細(xì)胞）絕對計(jì)數(shù)持續(xù)減少CD8+T細(xì)胞（Ts細(xì)胞）增高，到疾病晚期時下降T細(xì)胞亞群比例倒置，CD4+細(xì)胞功能受損51、了解機(jī)體的免疫狀態(tài)以進(jìn)行疾病分期；2、預(yù)測疾病進(jìn)展，判斷并發(fā)癥的出現(xiàn)；3、確定開始HAART的指征；4、藥物療效的評價指標(biāo)；大多數(shù)病毒完全抑制者，CD4計(jì)數(shù)平均每年增加100個/mm3。CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量檢測的意義62-6weeksmeanof10yearsAsymptomaticphaseFlu-likeDiseaseSymptom-aticphaseAIDS10005002000CD4Tcells/mlInfectionSeroconversionDeathCD4TcelldepletionHAART7CD4+T細(xì)胞臨床階段A無癥狀或急性HIV感染或持續(xù)性全身淋巴結(jié)腫大B出現(xiàn)癥狀，不是A或CC艾滋病指針性癥狀>500/ul（≥29%）A1B1C1200-499/ul（14-28%）A2B2C2<200/ul（<14%）A3B3C3

成人及青少年艾滋病分期標(biāo)準(zhǔn)（CDC，美國，1993年）

CD4<200/ul和/或出現(xiàn)艾滋病指針性癥狀（如卡氏肺囊蟲肺炎等）時，就可定義為進(jìn)入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。8

并發(fā)癥與CD4細(xì)胞數(shù)的關(guān)系（ArchInternMed,1995,155）

CD4細(xì)胞數(shù)感染性并發(fā)癥非感染性并發(fā)癥

500/mm3急性逆轉(zhuǎn)錄病毒綜合征持續(xù)性全身淋病腺病

念珠菌性陰道炎吉蘭-巴雷綜合征肌病

無菌性腦膜炎

200~500/mm3肺炎球菌和其它細(xì)菌性肺炎子宮頸上皮肉瘤宮頸癌

肺結(jié)核帶狀皰疹鵝口瘡特異性B細(xì)胞淋巴瘤

隱孢子蟲病貧血多發(fā)性單神經(jīng)炎

卡波濟(jì)肉瘤口腔毛壯白斑病特發(fā)性血小板減少性紫癜

何奇金淋巴瘤淋巴細(xì)胞間質(zhì)肺炎

200/mm3卡氏肺孢子蟲肺炎消瘦周圍神經(jīng)紊亂HIV相關(guān)癡呆

組織孢漿菌病球孢子菌病心肌病空泡性脊髓炎

粟粒性/肺外結(jié)核進(jìn)行性多發(fā)性神經(jīng)根病

多發(fā)性多灶性腦白質(zhì)病何奇金淋巴瘤

100/mm3彌漫性單純皰疹弓形體病

隱球菌病慢性陰孢子蟲病

微孢子蟲病念珠菌食道炎

50/mm3彌漫性巨細(xì)胞病毒感染中樞神經(jīng)淋巴瘤

鳥分枝桿菌綜合征

9確定抗HIV藥物治療開展的時機(jī)及進(jìn)行療效評價《艾滋病診斷與治療指導(dǎo)方案》（試行，2002年）

病程CD4+T淋巴細(xì)胞病毒載量建議癥狀期任何值任何值治療無癥狀期CD4+T細(xì)胞<200/mm3任何值治療無癥狀期CD4+T細(xì)胞>200/mm3，但<350/mm3>30000（bDNA）或>55000(RT-PCR)建議治療。另外還要根據(jù)CD4+T細(xì)胞下降率和患者的愿望無癥狀期CD4+T細(xì)胞>350/mm3<30000（bDNA）或<55000(RT-PCR)建議延遲治療觀察。未經(jīng)治療者3年發(fā)展至AIDS<15%.10雖然CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)是監(jiān)測HIV病程的評價工具，但是單獨(dú)的CD4+T細(xì)胞數(shù)減少不是HIV感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其它的免疫缺陷狀況也可以有輔助性T-淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的結(jié)果:

-丙球蛋白缺乏癥

-胸腺發(fā)育不全(DiGeorge氏綜合癥)

-嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷提示11生理狀況和疾病對CD4+細(xì)胞

計(jì)數(shù)的影響?晝間變化：最低值是中午12：00左右，最高值是晚上8：30左右，還有季節(jié)變化?急性感染和免疫接種：CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)減少?藥物：腎上腺皮質(zhì)激素使CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)↓?性別、成人的年齡、妊娠、心理壓力等對CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)影響很小?避免在并發(fā)感染治療后或免疫接種后4周內(nèi)檢測12結(jié)果解釋?至少連續(xù)2次CD4+細(xì)胞檢測均顯著變化時，才能說明CD4+確實(shí)發(fā)生了變化。?

CD4+細(xì)胞絕對數(shù)改變30%以上，或CD4+細(xì)胞百分比改變>3個百分點(diǎn)才有意義。?例如：CD4+細(xì)胞數(shù)為500/μl、CD4+細(xì)胞百分比為20%的病人，連續(xù)兩次CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)下降，絕對數(shù)減少至340/μl，百分比降低為16%，說明CD4+細(xì)胞確實(shí)發(fā)生了顯著性變化13儀器的選擇1、中央級、省級、研究所、高校、醫(yī)院：流式細(xì)胞儀（FACSCalibur、Coulter)2、地區(qū)級及示范區(qū)：專門的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（FACSCount、Guava)3、現(xiàn)場及鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院：（手工方法：如Dynabeads）4、除此之外，在不具備CD4檢測的實(shí)驗(yàn)室，WHO建議用總淋巴細(xì)胞來代替。（當(dāng)總淋巴細(xì)胞小于1000/ul時，強(qiáng)烈預(yù)示CD4細(xì)胞小于200/ul。14流式細(xì)胞儀工作原理15流式細(xì)胞儀就是進(jìn)行流式細(xì)胞分析的儀器，它集電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體理論于一體，是一種非常先進(jìn)的檢測儀器。16流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)單個細(xì)胞分析同時多參數(shù)分析速度快：10000個細(xì)胞/秒統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細(xì)胞17流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM,又名FACS）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細(xì)胞）的多項(xiàng)特性的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量工作原理18流式細(xì)胞儀儀器結(jié)構(gòu)液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 激光光源 光收集系統(tǒng)電子系統(tǒng) 光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)19InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式細(xì)胞儀流動室示意圖20細(xì)胞被戴上特殊的標(biāo)記。所用的標(biāo)記細(xì)胞的探針是能夠同待分選細(xì)胞表面特征性蛋白(抗原)結(jié)合的抗體，而這種抗體又能夠同某種熒光染料結(jié)合。被結(jié)合的細(xì)胞帶上了熒光標(biāo)記。當(dāng)稀釋的細(xì)胞進(jìn)入超聲波振蕩器時，極稀的細(xì)胞懸浮液形成很小的液滴，一個液滴中只含有一個細(xì)胞。液滴一旦形成并通過激光束時，激光束激發(fā)結(jié)合在細(xì)胞表面抗體分子。21FACSCaliburTM系統(tǒng)選配BDBTritest/TruCOUNTTM

試管22樣本的采集、處理

EDTA（血液）抗凝血采血后立即握住試管兩端，顛倒混勻數(shù)次，將血液與抗凝劑混勻，以防止凝固。收集樣品應(yīng)在30h以內(nèi)，盡早（8h以內(nèi)）處理。23樣本的運(yùn)送在室溫下（18

23℃）保存和運(yùn)輸樣品，避免極端溫度（冷凍或過熱）。超過37℃的溫度會破壞細(xì)胞，對血液學(xué)和流式細(xì)胞儀的檢測有影響。不可檢測溶血或結(jié)冰的樣品。不可檢測凝血的樣品。如果樣品的采集時間已超出48h，不可檢測。24試劑BD公司CD3/4/8聯(lián)合抗體BD公司TruCount管25操作步驟20ul抗體50ul全血混勻，避光靜置15分鐘混勻，避光15分鐘450μLFACS溶血液(1x)26應(yīng)用軟件MultiSETFACS系列流式細(xì)胞分析儀使用的全自動軟件外周血直接多色熒光分析自動獲取標(biāo)本，分析數(shù)據(jù)獲得關(guān)于外周血中淋巴細(xì)胞各類亞型細(xì)胞的信息絕對計(jì)數(shù)，直接給出結(jié)果。TruCOUNT27檢測外周血，計(jì)算淋巴細(xì)胞及待測亞型的相對含量和絕對含量使用直接熒光標(biāo)記抗體，一步完成三色或四色熒光標(biāo)記免洗試劑設(shè)計(jì)，操作簡便，減少細(xì)胞丟失質(zhì)量控制保證28CD4絕對計(jì)數(shù)結(jié)果樣本編號名稱檢測結(jié)果散點(diǎn)圖實(shí)驗(yàn)室報告29正常參考值測定結(jié)果臨床報告30MultiSET注意事項(xiàng)使用精密加樣器，準(zhǔn)確加取50

l標(biāo)本，建議使用反向加樣法TruCOUNT管批號不同，beads含量不同，更換批號時注意更改MultiSET中的LotId和beadscount。不同批號的TruCOUNT管不能混用TruCOUNT管應(yīng)在2-25

C密封干燥保存，取出后應(yīng)在1小時內(nèi)使用請配套使用FACS溶血液應(yīng)使用新鮮標(biāo)本進(jìn)行試驗(yàn)31內(nèi)置微處理器實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)自動分析自動打印質(zhì)控與病人的檢測結(jié)果簡單易用的系統(tǒng)控制面板配套的樣本制備工作臺簡捷的樣本制備方法，避免細(xì)胞損失BDBFACSCountTM系統(tǒng)32儀器特點(diǎn)樣本穩(wěn)定性制備后室溫(20—250C)儲存48小時全血穩(wěn)定性采集后室溫(20—250C)儲存48小時范圍CD4+:50-2000個細(xì)胞/uLCD8+:100-2000個細(xì)胞/uLCD3+:100-3500個細(xì)胞/uL33CD4+T細(xì)胞檢測的質(zhì)量控制質(zhì)量控制是指在每一次實(shí)驗(yàn)過程中為確保實(shí)驗(yàn)工作正常進(jìn)行而必須采取的各種措施。34實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證工