第3章生物技術(shù)制藥

第三章基因工程制藥2023/10/171蘇州大學(xué)第一節(jié)概述生物技術(shù)的核心就是基因工程，基因工程技術(shù)最成功的應(yīng)用就是用于生物治療的新型生物藥物的研制。傳統(tǒng)生物藥物由于來源及制備上的困難、價格等因素的影響，此外在制備過程可能受到的病毒、衣原體、支原體等的感染等問題，促使人們尋求安全、實用、療效可靠的新方法來制備生物藥物。2023/10/172蘇州大學(xué)應(yīng)用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決上述提到的問題，從量、質(zhì)上都可以得到改進，且可以創(chuàng)造全新物質(zhì)。癌癥、病毒性疾病、心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預(yù)防、治療和診斷已可通過基因工程技術(shù)獲得。2023/10/173蘇州大學(xué)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點：可以大量生產(chǎn)生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾素、細胞因子等），為臨床使用提供有效的保障；可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進行深入的研究，從而擴大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍；利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；2023/10/174蘇州大學(xué)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點：內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足之處，可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進行改造和去除。利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。

2023/10/175蘇州大學(xué)第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程基因工程技術(shù)：將目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細胞，構(gòu)建工程菌（或細胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進行復(fù)制和表達的技術(shù)?；蚬こ趟幬镏圃斓闹饕绦蚴牵耗康幕虻目寺。瑯?gòu)建DNA重組體，將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌，工程菌的發(fā)酵，外源基因表達產(chǎn)物的分離純化，產(chǎn)品的檢驗等。2023/10/176蘇州大學(xué)獲得目的基因組建重組質(zhì)粒培養(yǎng)工程菌工程菌或細胞產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定包裝成品檢定基因工程藥物制備的一般過程2023/10/177蘇州大學(xué)3.基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游上游：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細胞）構(gòu)建。上游階段的工作主要在實驗室內(nèi)完成；下游：主要指的是從工程菌（或細胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等。2023/10/178蘇州大學(xué)一、工程菌（或細胞）構(gòu)建中重要的工具1.工具酶：限制性內(nèi)切酶和連接酶2.基因：對目的基因DNA進行序列分析。3.表達系統(tǒng)：原核生物和真核生物兩類表達系統(tǒng)；選擇基因表達的系統(tǒng)主要考慮的是保證表達蛋白質(zhì)的功能，其次要考慮的是表達量的多少和分離純化的難易。2023/10/179蘇州大學(xué)二、下游階段在產(chǎn)業(yè)化中是極其重要的1、下游階段總目標：是將實驗室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化。2、下游階段主要工作：工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計和制造，電子計算機的優(yōu)化控制等。2023/10/1710蘇州大學(xué)第三節(jié)目的基因的獲得2023/10/1711蘇州大學(xué)第三節(jié)目的基因的獲得一、逆轉(zhuǎn)錄法1、mRNA的純化2、cDNA第一鏈的合成3、cDNA第二鏈的合成4、cDNA克隆5、將重組體導(dǎo)入宿主細胞6、cDNA文庫的鑒定7、目的cDNA克隆的分離和鑒定2023/10/1712蘇州大學(xué)cDNA克隆示意圖mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNADNA多聚酶IKlenow片段逆轉(zhuǎn)錄酶ds-cDNAds-cDNA2023/10/1713蘇州大學(xué)1、mRNA的純化分離純化目的基因的mRNA極其困難；mRNA占細胞內(nèi)總RNA總量的2%~5%，易降解；mRNA特點：在真核細胞中mRNA的3‘末端常常含有一多聚腺苷酸polyA組成的末端，長達20~250個腺苷酸；分離辦法：可采用Oligo

dT-纖維素，以親和層析法。洗脫方法是高濃度鹽溶液使mRNA特異結(jié)合于寡聚dT，再以低鹽溶液和蒸餾水將其洗脫，經(jīng)過兩次寡聚dT，可得到較純的mRNA。2023/10/1714蘇州大學(xué)2、cDNA第一鏈的合成一般mRNA都帶有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。一次好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可使寡聚dT選出的mRNA有5%~30%被拷貝。2023/10/1715蘇州大學(xué)3、cDNA第二鏈的合成堿解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈；以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3‘末端往往形成一個發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，所以，可以從這一點開始合成cDNA第二鏈。此反應(yīng)是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1專一性切除單鏈DNA（發(fā)夾結(jié)構(gòu)），變性瓊脂糖凝膠電泳檢測雙鏈cDNA分子的大小。2023/10/1716蘇州大學(xué)cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mRNAcDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs2023/10/1717蘇州大學(xué)cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS12023/10/1718蘇州大學(xué)cDNA第二鏈的合成

DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5GGAAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’S1AAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA5’5’TTTTTTTTTTTTTT3’3’T4-DNAligase2023/10/1719蘇州大學(xué)cDNA第二鏈的合成

dCTPTdT引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5GGAAAAAOH

3’TTTTTp

5’3‘

HO5‘ppp’5GGAAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGG3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’NaOH退火KlenowdNTPs2023/10/1720蘇州大學(xué)4、cDNA克隆兩類用于cDNA克隆的載體：載體DNA來源：質(zhì)粒DNA（如pUC、pBR322等）噬菌體DNA（如

gt10、

gt11等）是否表達：表達型非表達型載體2023/10/1721蘇州大學(xué)4、cDNA克隆pUC及gt11為表達型載體，在cDNA插入位置的上游具有啟動基因順序；而pBR322及gt10為非表達型載體。在cDNA克隆操作中應(yīng)該根據(jù)不同的需要選擇適當?shù)妮d體。cDNA插入片段小于10kb，可選質(zhì)粒載體，如大于10kb則應(yīng)選用噬菌體DNA為載體。選用表達型載體可以增加目的基因的篩選方法，有利于目的基因的篩選。2023/10/1722蘇州大學(xué)cDNA文庫R.Young和R.Davis設(shè)計的

gt10和gt11是噬菌體克隆載體，可用于構(gòu)建cDNA文庫。一方面它們具有較高的克隆效率，1ngcDNA可產(chǎn)生5000個克隆，另一方面又可容納較大分子量的外源DNA片段。因為篩選噬菌斑在技術(shù)操作上較篩選細菌菌落更方便，因此gt10和gt11類載體在構(gòu)建文庫時優(yōu)于質(zhì)粒載體pBR322。2023/10/1723蘇州大學(xué)

gt10載體cDNA插入到gt10中可使噬菌體阻遏物基因（cI）失活。當用大腸桿菌c600的突變型hflA（高頻溶原性）作為宿主時，只有攜帶cDNA插入片段的噬菌體可形成噬菌斑；而在非突變型大腸桿菌c600宿主菌中，帶與不帶cDNA插入片段的噬菌體都可形成噬菌斑。2023/10/1724蘇州大學(xué)

gt11載體蛋白質(zhì)表達的cDNA克隆載體；宿主菌是大腸桿菌Y1090；

gt11中cDNA插入片段是克隆在lacZ的羧基端，可表達成半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白，帶cDNA插入片段的gt11可形成清晰的無色噬菌斑；未帶cDNA插入片段的gt11則形成藍色噬菌斑。2023/10/1725蘇州大學(xué)cDNA片段與載體的連接（1）、加同聚尾連接：（2）、加人工接頭連接：為了保護cDNA不受限制酶破壞，可在加接頭前用甲基化酶修飾這些限制酶切位點。2023/10/1726蘇州大學(xué)5、將重組體導(dǎo)入宿主細胞體外包裝的噬菌體，感染感受態(tài)大腸桿菌形成噬菌斑；轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌使質(zhì)粒進入細胞內(nèi)。2023/10/1727蘇州大學(xué)6、cDNA文庫的鑒定（1）根據(jù)重組體的表型進行篩選：抗性基因失活法菌落或噬菌斑顏色改變法凝膠電泳分子雜交DNA序列分析測定2023/10/1728蘇州大學(xué)7、目的cDNA克隆的分離和鑒定從cDNA文庫中分離特異的cDNA克隆，主要采用：（1）核酸探針雜交法：（2）免疫反應(yīng)鑒定法2023/10/1729蘇州大學(xué)分離得到含有目的基因的陽性克隆后，必須對其作進一步的驗證和鑒定，主要是進行限制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因定位、基因測序以及確定基因的轉(zhuǎn)錄方向、轉(zhuǎn)錄起始點等。1985，PCR發(fā)明以后，RT-PCR得到了廣泛的應(yīng)用。2023/10/1730蘇州大學(xué)二、化學(xué)合成法人工化學(xué)合成的限制：不能合成太長的基因，50~60bp；是人工合成時，遺傳密碼的簡并性可導(dǎo)致中性突變；是費用較高。2023/10/1731蘇州大學(xué)化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成化學(xué)合成目的基因有三種戰(zhàn)略：小片段粘接法：

混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

2023/10/1732蘇州大學(xué)化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成補釘延長法：

混合退火根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合2023/10/1733蘇州大學(xué)化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成大片段酶促法：

混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合2023/10/1734蘇州大學(xué)第四節(jié)基因表達需重點考慮的問題：目的基因的表達量，表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性，產(chǎn)物的生物學(xué)活性，表達產(chǎn)物的分離純化。在進行基因表達設(shè)計時，需綜合考慮各種影響因素以建立最佳基因表達體系。2023/10/1735蘇州大學(xué)一、宿主細胞的選擇1、作為宿主細胞的條件：容易獲得較高濃度的細胞；能利用易得廉價原料；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；發(fā)熱量低，需氧低，適當?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)，容易進行代謝調(diào)控；容易進行DNA重組技術(shù)操作；產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取純化。2023/10/1736蘇州大學(xué)2、兩類宿主細胞：原核細胞：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等；真核細胞：酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞等。2023/10/1737蘇州大學(xué)（1）、原核細胞-1A：大腸桿菌表達產(chǎn)物的形式：①細胞不溶性表達（包含體）②細胞內(nèi)可溶性表達③細胞周質(zhì)表達④分泌到細胞外表達。2023/10/1738蘇州大學(xué)表達的特點：①不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物；②分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，產(chǎn)物須在下游處理過程中經(jīng)過變性和復(fù)性處理才能恢復(fù)其生物活性；

③不存在翻譯后修飾作用；

④翻譯通常從甲硫氨酸的AUG密碼子開始，故目的蛋白質(zhì)的N端常多余一個甲硫氨酸殘基，容易引起免疫反應(yīng)；⑤產(chǎn)生的內(nèi)毒素難以除去。2023/10/1739蘇州大學(xué)（1）、原核細胞-2B：枯草芽孢桿菌分泌能力強，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體。不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化，胞外蛋白酶活性強，會對產(chǎn)物進行不同程度的降解。2023/10/1740蘇州大學(xué)（1）、原核細胞-3C：鏈霉菌主要特點不致病、使用安全，分泌能力強，具有糖基化能力。2023/10/1741蘇州大學(xué)（2）、真核細胞-1Ａ：酵母（Saccharomycescerevisiae）

特點：①有后翻譯加工過程；②基因組小，僅為大腸桿菌的4倍；③世代時間短，有單倍體和雙倍體兩種形式；④基因操作與原核生物相似；⑤可以建立有分泌功能的表達系統(tǒng)，將產(chǎn)物分泌出胞外，分離純化工藝相對簡單。2023/10/1742蘇州大學(xué)（2）、真核細胞-2B:絲狀真菌約30種以上絲狀真菌中建立了DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，特點：有很強的蛋白分泌能力；能正確進行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其糖基化方式與高等真核生物相似；絲狀真菌（如曲霉等）等又確認是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。2023/10/1743蘇州大學(xué)(2)、真核細胞-3C:哺乳動物細胞表達產(chǎn)物可分泌，控制細胞培養(yǎng)成分使產(chǎn)物純化變得容易。后加工完善，接近或類似于天然產(chǎn)物。動物細胞生產(chǎn)慢，產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費用高，培養(yǎng)液濃度較稀。2023/10/1744蘇州大學(xué)二、大腸桿菌中的基因表達1、載體表達載體必須具備的條件載體能獨立地進行復(fù)制；應(yīng)具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，應(yīng)具有很強的啟動子，能為大腸桿菌的RNA酶所識別。2023/10/1745蘇州大學(xué)表達載體必須具備的條件應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導(dǎo)時才進行轉(zhuǎn)錄。阻遏子的阻遏作用可以由物理（如溫度）、化學(xué)（如IPTG、IAA等）因素進行調(diào)節(jié)，因而可人為地選擇啟動子啟始轉(zhuǎn)錄mRNA的時機，以獲得外源蛋白質(zhì)表達合成的最佳時機。外源基因的高效表達往往會抑制宿主細胞的生長、增殖，而阻遏子可使宿主細胞免除此不良影響。2023/10/1746蘇州大學(xué)表達載體必須具備的條件應(yīng)具有很強的終止子，優(yōu)點：1）使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無關(guān)的基因2）所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定3）防止因強啟動子所致的高水平轉(zhuǎn)錄而引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定或脫質(zhì)?，F(xiàn)象。2023/10/1747蘇州大學(xué)表達載體必須具備的條件所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列（Shine-Dalgarnosequence），以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。

pBV220系統(tǒng)和pET系統(tǒng)。2023/10/1748蘇州大學(xué)2、影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素（1）外源基因的拷貝數(shù)（2）外源基因的表達效率啟動子的強度核糖體結(jié)合位點的有效性SD序列和起始密碼ATG的間距密碼子的組成2023/10/1749蘇州大學(xué)2、影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素（3）表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性：①組建融合蛋白；②利用大腸桿菌的信號肽或真核多肽中自身的信號肽；③采用位點突變的方法；④選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細胞，可能會減弱表達產(chǎn)物的降解。2023/10/1750蘇州大學(xué)2、影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素（4）細胞的代謝負荷表達產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，可能對宿主細胞有毒性。調(diào)節(jié)表達產(chǎn)物的積累與細胞的生長、代謝之間的平衡有利于外源基因的高效表達；通過將細胞的生長和外源基因的表達分成兩個階段，或?qū)⑺拗骷毎纳L與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開兩種手段也可以減輕細胞代謝的負荷；形成不溶性的包含體可以降低表達產(chǎn)物對宿主細胞的毒害作用。2023/10/1751蘇州大學(xué)2、影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素（5）工程菌的培養(yǎng)條件除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源基因的高水平表達外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。2023/10/1752蘇州大學(xué)3、真核基因在大腸桿菌中的表達形式（1）融合蛋白的形式（2）非融合蛋白的形式2023/10/1753蘇州大學(xué)3、真核基因在大腸桿菌中的表達形式（3）分泌型表達蛋白藥物基因：常用的信號肽有：堿性磷酸酶信號肽（phoA）、膜外周質(zhì)蛋白信號肽（OmpA）、霍亂弧菌毒素B亞單位（CTXB）。2023/10/1754蘇州大學(xué)三、酵母中的基因表達酵母表達系統(tǒng)的關(guān)鍵酵母質(zhì)粒酵母轉(zhuǎn)化技術(shù)包括載體、啟動子控制的序列和宿主細胞3個部分。2023/10/1755蘇州大學(xué)1、載體——（1）載體的復(fù)制序列（1）載體的復(fù)制序列：分為四大類：①Yep類（yeastepisomalplasmid，酵母附加體質(zhì)粒）：復(fù)制序列：2質(zhì)粒（酵母天然質(zhì)粒）的復(fù)制起點區(qū)及REp3基因區(qū)。特點：拷貝數(shù)高、高轉(zhuǎn)化頻率、穩(wěn)定性好。②Ypp類（yeastreplicationplasmid，酵母復(fù)制型質(zhì)粒）復(fù)制序列：酵母染色體的自主復(fù)制序列（autonomousreplicationsequence，ARS）特點：穩(wěn)定性差，拷貝數(shù)少，轉(zhuǎn)化頻率為103~105/gDNA。2023/10/1756蘇州大學(xué)1、載體——（1）載體的復(fù)制序列③YCp；類（yeastcentromericplasmid，酵母著絲粒質(zhì)粒）復(fù)制序列：ARS，并且含有酵母染色體中心粒、端粒序列。特點：類似染色體的單位，參與細胞有絲分裂和減數(shù)分裂，在子代細胞中精確地分配。但它們的拷貝數(shù)只有1個，轉(zhuǎn)化頻率為103~104/gDNA。2023/10/1757蘇州大學(xué)1、載體——（1）載體的復(fù)制序列④YIp類（yeastintergrativeplasmid，酵母整合型質(zhì)粒）特點：含有可與酵母染色體重組的序列，可以完全整合到染色體中。具有很好的穩(wěn)定性。拷貝數(shù)只有一個，轉(zhuǎn)化頻率為1~100/gDNA。2023/10/1758蘇州大學(xué)1、載體——（2）克隆載體要求：克隆載體既可以在細菌中進行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇，又能在酵母中進行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇。（穿梭）2023/10/1759蘇州大學(xué)1、載體——（3）表達載體普通表達載體：可方便地引入外源基因并進行表達，對表達產(chǎn)物的組成，特別是對其N末端氨基酸是否增減并無嚴格要求。精確表達載體：（1）要求適當部位有內(nèi)切酶點，以利于接入外源基因，（2）表達產(chǎn)物加工后N末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同。2023/10/1760蘇州大學(xué)2、影響目的基因在酵母菌中表達的因素（1）外源基因的拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)及其在宿主細胞內(nèi)的穩(wěn)定性對外源基因的表達起決定作用。幾種常見的現(xiàn)象：質(zhì)粒傳代培養(yǎng)中丟失；整合到酵母染色體，雖然穩(wěn)定，但通常為單拷貝；高拷貝數(shù)質(zhì)粒通常會引起細胞生長量的降低從而影響表達；而單拷貝數(shù)的質(zhì)粒對細胞的最大生長沒有影響，因而也能達到高效表達。2023/10/1761蘇州大學(xué)（2）外源基因的表達效率—啟動子外源基因在酵母中表達的效率主要與啟動子、分泌信號和終止序列有關(guān)。啟動子：上游激活序列、近端啟動（轉(zhuǎn)錄所必需的TATA序列、mRNA起始轉(zhuǎn)錄位點、起始密碼子）終止區(qū)：含有終止mRNA轉(zhuǎn)錄所需的信號。2、影響目的基因在酵母菌中表達的因素2023/10/1762蘇州大學(xué)常用啟動子有組成型和誘導(dǎo)型啟動子啟動子類型所用的基因基因符號組成型磷酸甘油酸激酶PGK烯醇酶ENOL3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH乙醇脫氫酶1ADH1磷酸三糖異構(gòu)酶TRI信息素-因子

MF

1誘導(dǎo)型細胞色素CCYC1酸性磷酸脂酶

PHO5半乳糖激酶

GAL1

UDP-D-半乳糖-4-差向酶

GAL102、影響目的基因在酵母菌中表達的因素2023/10/1763蘇州大學(xué)分泌信號的效率：分泌信號是酵母菌表達蛋白的起始分泌、糖基化和蛋白折疊加工等不可缺少的因素。終止序列的影響：終止序列保證產(chǎn)物（mRNA）在適當部位終止和加上polyA尾部，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。2、影響目的基因在酵母菌中表達的因素2023/10/1764蘇州大學(xué)（3）外源蛋白的糖基化N-糖苷鍵（天冬酰胺連接）和O-糖苷鍵（絲氨酸或蘇氨酸連接）的兩種不同的糖基化，與哺乳動物中發(fā)生的糖基化相同外源蛋白經(jīng)釀酒酵母合成、氨基末端修飾、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)折疊和糖基化后，可靠有效地以活性型分泌到培養(yǎng)基中，而且某些蛋白質(zhì)糖基化后更加穩(wěn)定，便于分離精制。2、影響目的基因在酵母菌中表達的因素2023/10/1765蘇州大學(xué)（4）宿主菌株的影響表達用的酵母宿主菌株應(yīng)具備下列要求：①菌體生長力強；②菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱；③菌株性能穩(wěn)定，常用的幾乎是突變株，避免使用回復(fù)突變率高的不穩(wěn)定體系；最好使用二倍體或多倍體菌株；④分泌能力強。2、影響目的基因在酵母菌中表達的因素2023/10/1766蘇州大學(xué)四、動物中的基因表達優(yōu)點：產(chǎn)物類似于天然產(chǎn)物，容易分離純化缺點：動物細胞生長慢，培養(yǎng)條件苛刻，費用高培養(yǎng)液濃度較小。2023/10/1767蘇州大學(xué)第五節(jié)基因工程菌的穩(wěn)定性一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因由于分裂的原因而不穩(wěn)定；質(zhì)粒的拷貝數(shù)所決定的不穩(wěn)定；培養(yǎng)條件；質(zhì)粒穩(wěn)定性分析方法：先在不含抗性標記培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再于含抗性標記培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)比值計算質(zhì)粒的穩(wěn)定性。2023/10/1768蘇州大學(xué)質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法不含抗性標記抗生素

平板培養(yǎng)基10-12h100個菌落含抗性標記抗生素平板培養(yǎng)基

10-12h統(tǒng)計生長菌落數(shù)重復(fù)三次,計算比值

(穩(wěn)定性stability)樣品2023/10/1769蘇州大學(xué)二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法兩階段法：第一階段先使菌體生長至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達。壓力法：在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等，以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，也是提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法。調(diào)控的環(huán)境參數(shù)：溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度。2023/10/1770蘇州大學(xué)含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過間歇供氧和改變稀釋速率，可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。2023/10/1771蘇州大學(xué)第六節(jié)基因工程菌發(fā)酵基因工程菌的培養(yǎng)過程主要包括：