第7章 現(xiàn)代生物技術(shù)(一)

人工基因組的設(shè)計(jì)與合成李炳志bzli@2013-041第七章

現(xiàn)代生物技術(shù)(一)李炳志bzli@2013-042第七章

現(xiàn)代生物技術(shù)(一)DNA重組技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)3DNA重組DNA重組是指由于不同DNA鏈的斷裂和連接而產(chǎn)生的DNA片段的交換和重新組合，形成新的DNA分子的過程。自然DNA重組DNA重組人工DNA重組4復(fù)制翻譯轉(zhuǎn)錄不同來源的DNA分子重組DNA分子5自然DNA重組：指細(xì)胞基因組中DNA順序重新排列組合的現(xiàn)象。人工DNA重組：指在體外用人工（酶學(xué)）的方法將目的基因與載體DNA重組，并把重組體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使目的基因擴(kuò)增和表達(dá)的技術(shù)。6自然基因重組的方式

1．接合:指供體細(xì)胞（細(xì)菌）和受體細(xì)胞（細(xì)菌）

接觸，使DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的過程。.例:較大質(zhì)粒在細(xì)菌間的轉(zhuǎn)移2．轉(zhuǎn)化：指外源DNA被引入細(xì)胞，導(dǎo)致其遺傳和生物性狀改變的過程。例：細(xì)菌抗藥性3．轉(zhuǎn)導(dǎo)：以病毒為媒介、將供體菌的DNA片段轉(zhuǎn)移到受體菌基因組的過程。

例：噬菌體感染宿主菌

74．轉(zhuǎn)座：指可移動(dòng)的DNA序列（游動(dòng)基因）從基因組的一處移動(dòng)到另一處的過程。a.插入序列：轉(zhuǎn)座酶基因＋反向重復(fù)序列b.轉(zhuǎn)座子定義：可從染色體一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散的重復(fù)序列。8DNA重組的類型1、同源重組（HomologousRecombination）2、位點(diǎn)特異性重組（Site-specificRecombination）3、DNA的轉(zhuǎn)座（transposition）9同源重組

1、定義：兩個(gè)DNA分子同源序列之間進(jìn)行的重組2、條件：（1）兩個(gè)DNA分子有同源序列（相關(guān)的酶可以用任何一對(duì)同源序列為底物）（2）兩個(gè)DNA分子必須緊密接觸3、發(fā)生：真核生物:非姐妹染色單體交換相對(duì)應(yīng)的區(qū)域。原核生物:依賴recA蛋白，并形成Holliday 結(jié)構(gòu)10斷裂和重連產(chǎn)生異源雙鏈DNA1.同源序列排列在一起；2.酶切。通過核酸酶和RecBCD蛋白復(fù)合體的作用在一對(duì)同源DNA上產(chǎn)生切口；3.入侵。含有3’端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA細(xì)絲；RecA-ssDNA細(xì)絲尋找相對(duì)的DNA雙螺旋上的相應(yīng)序列。細(xì)菌同源重組的機(jī)制---Holiday重組模型114.游離端交叉連接，形成Holliday

結(jié)構(gòu)5.通過分支遷移產(chǎn)生異源雙鏈DNA。十字形結(jié)構(gòu)126.空間重排。十字型兩臂旋轉(zhuǎn)180度7.解離(兩種不同方式)8.修補(bǔ)連接13位點(diǎn)特異性重組一、定義：不依賴于DNA順序的同源性，而依賴于能與某些酶相結(jié)合的特異的DNA序列的存在。例子：噬菌體λ對(duì)E.coliDNA的整合

（一）λDNA存在兩種形式裂解狀態(tài)溶源狀態(tài)（二）通過位點(diǎn)特異性重組實(shí)現(xiàn)兩種類型間的轉(zhuǎn)換

λDNA整合到宿主DNA進(jìn)入溶源狀態(tài)

λDNA從宿主DNA中切離進(jìn)入裂解狀態(tài)14（三）催化重組的酶

1、整合酶Int(integrase)：有拓?fù)洚悩?gòu)酶活性

2、整合宿主因子（IHF，integrationhostfactor）

3、切除酶（excisionase）/終止重組（四）重組位點(diǎn)：附著位點(diǎn)（attachmentsite）

attP（POP’）和attB（BOB’）有15bp核心序列配對(duì)（五）重組過程：

1、整合：POP’+BOB’→BOP’—POB2、切離：BOP’—POB’→POP’+BOB’15λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖）16attPattB17DNA的轉(zhuǎn)座一、轉(zhuǎn)座子（transposon）的定義：

存在于染色體DNA上可自主轉(zhuǎn)移座位的基本單位

二、轉(zhuǎn)座子發(fā)現(xiàn)：

McClintockB：1938年，提出轉(zhuǎn)座基因概念

1983年，獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

J.Shapiro等：1980年，證實(shí)了可移位的遺傳基因存在18DNA的轉(zhuǎn)座復(fù)制型轉(zhuǎn)座：整個(gè)轉(zhuǎn)座子被復(fù)制，所移動(dòng)和轉(zhuǎn)位的僅僅是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。19DNA的轉(zhuǎn)座非復(fù)制型轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座子作為一個(gè)可移動(dòng)的單位直接被移位，留下一個(gè)供體位點(diǎn)（通常產(chǎn)生一個(gè)雙鏈斷裂的缺口）。20人工DNA重組技術(shù)克?。╟lone）：指由同一個(gè)始祖經(jīng)過無性繁殖所形成的副本或拷貝集合。克隆化：獲得同一拷貝的過程?；疽孛改康幕蜉d體基因宿主21DNA重組技術(shù)酶切連接轉(zhuǎn)化擴(kuò)增檢測(cè)目的基因的獲取克隆載體的構(gòu)建外源基因與載體的連接（體外重組）重組DNA導(dǎo)入受體菌轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定克隆基因的表達(dá)22重要的工具酶工具酶

基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、逆轉(zhuǎn)錄等相關(guān)的各種酶類。23限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)

是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識(shí)別和切割雙鏈DNA中的特定堿基序列的核酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶或切割酶。

根據(jù)限制酶作用特性，一般分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。

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限制酶（Ⅱ型）識(shí)別及切割位點(diǎn)特異識(shí)別及切割48個(gè)bp長度且具有回文序列的DNA片斷，主要產(chǎn)生3種末端結(jié)構(gòu)：5ˊ－粘性末端

3ˊ－粘性末端平端或鈍端

回文序列(palindrome)

是指該部位的核苷酸序列呈180O反向重復(fù);

粘性末端(stickyend)

是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出的堿基序列相互間具有互補(bǔ)性。25⑴產(chǎn)生5'-粘性末端

⑵產(chǎn)生3'-粘性末端26⑶產(chǎn)生平(頭末)端/鈍端其它特殊性質(zhì)的Ⅱ型限制酶同裂酶（異源同工酶）同尾酶可變酶27同裂酶

又稱異源同工酶。指來源不同，但具有相同的識(shí)別序列。在切割DNA時(shí)，其切割點(diǎn)可以是相同的，產(chǎn)生平頭末端，稱為同識(shí)同切；

切割點(diǎn)也可以是不同的，產(chǎn)生3ˊ或5ˊ粘性末端，稱為同識(shí)異切。28同裂酶——同識(shí)同切29同裂酶——同識(shí)異切30

同尾酶

指來源不同，但識(shí)別與切割順序有一定的相關(guān)性的一類酶。它們作用后產(chǎn)生相同的粘性末端。31可變酶識(shí)別順序中的一個(gè)或幾個(gè)堿基是可變的，并且識(shí)別順序往往超過6個(gè)堿基對(duì)。如，BstpⅠ，其識(shí)別順序?yàn)镚GTNACC。32

常用限制性核酸內(nèi)切酶的特性微生物名稱酶名稱識(shí)別順序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢桿菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢桿菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大腸桿菌