第17章 體內(nèi)藥物分析簡(jiǎn)介

第十七章體內(nèi)藥物分析簡(jiǎn)介第一節(jié)概述

一、體內(nèi)藥物分析的性質(zhì)

體內(nèi)藥物分析（生物藥物分析）是藥物分析的重要分枝，是隨著臨床藥學(xué)、臨床藥理學(xué)的發(fā)展和需要而建立起來(lái)的綜合性的應(yīng)用學(xué)科。體內(nèi)藥物分析——研究藥物在體內(nèi)的“命運(yùn)”通過(guò)分析手段了解藥物在體內(nèi)數(shù)量與質(zhì)量的變化，獲得藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)和代謝的方式、排泄的途徑等信息，為臨床藥學(xué)研究提供必要的數(shù)據(jù)和相關(guān)信息,有助于藥物生產(chǎn)、研究、臨床應(yīng)用等方面對(duì)藥物作出估計(jì)與評(píng)價(jià)。如果沒有體內(nèi)藥物分析提供的數(shù)據(jù)和相關(guān)信息，進(jìn)行臨床藥學(xué)研究是不可想象的。體內(nèi)藥物分析是一門研究生物機(jī)體中藥物及其代謝物和內(nèi)源性物質(zhì)的在體內(nèi)質(zhì)與量變化規(guī)律的分析方法學(xué)意義：（一）新藥評(píng)價(jià)和開發(fā)中的意義（二）臨床合理用藥中的意義（三）藥物作用機(jī)制探討藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)的安全性、有效性（四）代謝分型研究中應(yīng)用三、體內(nèi)藥物分析的對(duì)象和任務(wù)分析物：主要生物樣品中的藥物、體內(nèi)代謝物、活性的代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)生物樣品對(duì)象:人體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物樣品種類:體液（血液、尿液、唾液），另外還有頭發(fā)和器官組織等。體內(nèi)藥物分析的任務(wù)1.分析方法學(xué)的研究和完善

提供靈敏、專屬、準(zhǔn)確的分析方法與最佳分析條件

2.為藥物體內(nèi)研究提供數(shù)據(jù)提供藥物在動(dòng)物和人體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)、生物利用度及血漿蛋白結(jié)合率等基本數(shù)據(jù)3.為臨床治療藥物監(jiān)測(cè)提供準(zhǔn)確的血藥濃度測(cè)定值—提供藥學(xué)情報(bào)和信息,參與臨床科學(xué)用藥,確定最佳劑量,制定治療方案.4.體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的測(cè)定和研究氨基酸、激素、肌酐、草酸、尿酸等在體內(nèi)一定濃度范圍內(nèi)含量變化指示機(jī)體病變—為某些疾病的診斷及治療提供重要信息5.濫用藥物的檢測(cè)—為吸毒者體內(nèi)毒品和運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)禁藥的測(cè)定提供分析方法和可靠數(shù)據(jù).

體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)與要求一、體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)1．干擾物質(zhì)多2．樣品量少、不能重復(fù)取樣3．被測(cè)成分濃度低,對(duì)分析方法的靈敏度和專屬性要求較高.4．有時(shí)需要測(cè)定綴合物和代謝產(chǎn)物.5.供藥物濃度監(jiān)測(cè)的分析方法要求簡(jiǎn)便、快速６.工作量大，要有一定的儀器設(shè)備二、分析方法的新要求1.

檢測(cè)方法的高靈敏度（最低檢測(cè)量10-9~10-7g甚至10-15~10-12g）2.

分離方法的高選擇性、高專屬性3.分析方法應(yīng)達(dá)到要求的精密度、準(zhǔn)確度,具有穩(wěn)定且較高的回收率4.求解出實(shí)驗(yàn)與臨床上有意義的參數(shù)體內(nèi)藥物分析的發(fā)展概況

及熱點(diǎn)問(wèn)題

一、體內(nèi)藥物分析的發(fā)展概況20世紀(jì)60年代—臨床藥理學(xué)與生物藥劑學(xué)的建立70年代初—體內(nèi)藥物分析在國(guó)外開始建70年代末—血藥濃度監(jiān)測(cè)廣泛用于臨床80年代—體內(nèi)藥物分析學(xué)科日趨成熟90年代—微量、超微量分離、分析技術(shù)應(yīng)用

第二節(jié)生物樣品的種類、采集和制備

生物樣品種類臟器組織：體液：血液、尿液、唾液、毛發(fā)、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便等最常用的生物樣本

尿液—用于藥物劑量回收、尿清除率、生物利用度、內(nèi)源性活性物質(zhì)、藥物代謝分型及代謝物等的研究測(cè)定唾液—用于某些S/P較為恒定的藥物的測(cè)定

毛發(fā)—可用于藥物濫用監(jiān)測(cè)及微量元素測(cè)定肝、胃、腎、肺、腦等臟器組織—?jiǎng)游镌囼?yàn)研究藥物吸收、分布狀態(tài)及服藥過(guò)量中毒死亡1.血樣的采集一般用注射器直接采集靜脈血，每次1~5ml；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，采血量不宜超過(guò)動(dòng)物總血量的十分之一

注：測(cè)定血中藥物的濃度，通常是指測(cè)定血漿或血清中的藥物濃度，尤其是血漿，并非指全血血漿的制備采集的靜脈血液置含有抗凝劑的試管中，混合后，以2500~3000r/min離心5~10min使與血球分離，所得淡黃色上清液即為血漿（plasma）

血清的制備

采集的靜脈血液置試管中，于37℃或室溫放置30min~1h。血液凝固后，用細(xì)竹棒或玻璃棒輕輕剝?nèi)ピ嚬鼙谏系难灒僭?500~3000r/min離心5~10min，上層淡黃色液體即為血清（serum）

血清比血漿只是少一種纖維蛋白原C血漿=C血清血漿比血清的分離快，而且制取量約為全血的50%~60%（血清為全血的20%~40%），多數(shù)用血漿進(jìn)行分析。若血漿中含有的抗凝劑對(duì)藥物濃度測(cè)定有影響時(shí)，則應(yīng)使用血清樣品

全血的制備成分：血漿有形物質(zhì)：紅細(xì)胞白細(xì)胞血小板全血的制備將采集的血液置含有抗凝劑的試管中，但不經(jīng)離心操作，保持血漿和血細(xì)胞均相狀態(tài)，即為“全血”（wholeblood）

某些情況血漿內(nèi)藥物濃度波動(dòng)大，或血漿濃度低，可用全血（全血凈化較血漿和血清麻煩）血漿和紅細(xì)胞中分配比不是常數(shù)，則應(yīng)使用全血樣品

血樣主要應(yīng)用于：

藥物動(dòng)力學(xué)

生物利用度

臨床治療藥物濃度監(jiān)測(cè)（二）尿液(urine)

尿液用于：藥物劑量回收、藥物尿清除率、生物利用度的研究，預(yù)測(cè)藥物代謝過(guò)程、類型體內(nèi)藥物清除主要是通過(guò)尿液排出，藥物以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代謝物等多種形式排出性狀—淡黃色或黃褐色，相對(duì)密度1.105~1.020，pH4.8~8.0成分—水、含氮化合物、鹽類等微生物—防腐劑尿液的采集

樣本來(lái)源—自然排尿，成人一日排尿量為1~5L（隨時(shí)尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時(shí)間尿）

樣本采集—一般采集時(shí)間尿（規(guī)定時(shí)間內(nèi)采集尿液體積和排入尿中的藥物總量（三）唾液（saliva）

唾液—無(wú)損傷取樣，易收集；一些藥物的唾液藥濃(S)與血漿游離藥濃(P)密切相關(guān)，因此： —TDM中利用對(duì)S的測(cè)定代替對(duì)P的監(jiān)測(cè) —藥代動(dòng)力學(xué)的研究唾液采集

在潄口后15min，安靜狀態(tài)下采集口腔內(nèi)自然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣(需注意干擾)

唾液樣品采集后，應(yīng)立即測(cè)量其除去泡沫部分的體積，以3000rpm離心10min，取上清液直接測(cè)定或冷凍保存 生物樣品的貯存與處理冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1~2d)冷凍—冷柜(-20℃)或低溫冷柜(-80℃)中長(zhǎng)期保存注：冷藏或冷凍時(shí)限經(jīng)穩(wěn)定性考察后確定血樣：采集后及時(shí)分離血漿和血清（≤2h），分離后再貯存—若不予先分離，血凝后冰凍保存，則因冰凍有時(shí)易引起細(xì)胞溶解，會(huì)阻礙血漿或血清的分離—置硬質(zhì)玻璃試管中完全密塞后保存尿樣

采集后應(yīng)立即測(cè)定，若不能立即測(cè)定，加入防腐劑后保存 常用防腐劑：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、濃鹽酸等 甲苯在尿液表面形成薄膜醋酸改變尿液酸堿性抑制細(xì)菌的生長(zhǎng) 保存時(shí)間為24~36h(4℃)或長(zhǎng)期(-20℃)唾液

為阻止酶催化生成粘蛋白，應(yīng)在4℃以下保存 —保存過(guò)程中放出二氧化碳而使pH升高，測(cè)定唾液pH時(shí)應(yīng)在取樣的當(dāng)時(shí)為好—冷凍保存唾液時(shí)，解凍后有必要將容器內(nèi)唾液充分?jǐn)噭蚝笤儆茫駝t測(cè)定結(jié)果會(huì)產(chǎn)生誤差

第三節(jié)生物樣品的預(yù)處理與制備樣品預(yù)處理技術(shù)

分離、純化、富集或化學(xué)衍生化等，為藥物的最終測(cè)定創(chuàng)造良好的條件

樣品的預(yù)處理是體內(nèi)藥物分析中極為重要的環(huán)節(jié)；也是分析中最困難、最繁雜的工作

——對(duì)于生物樣品的預(yù)處理很難規(guī)定固定的程序和方式，必須結(jié)合測(cè)定實(shí)際和要求，采取恰當(dāng)?shù)姆椒ê图夹g(shù)一、生物樣品預(yù)處理的目的

使藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放

——定藥物的總濃度

使樣品純化——消除生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾

提高檢測(cè)靈敏度——適應(yīng)和符合測(cè)定方法要求的靈敏度

防止分析儀器的污染和劣化——提高分析儀器的耐受程度、改善分析結(jié)果二、方法的選擇

待測(cè)生物樣品的類型決定樣品預(yù)處理方法：

血漿、血清——常需去除蛋白質(zhì) 唾液——主要采用離心沉淀除去粘蛋白 尿液——常采用酸或酶法使綴合物水解 頭發(fā)——需要將頭發(fā)進(jìn)行有機(jī)破壞后測(cè)定微量元素1.藥物的理化性質(zhì)和存在形式酸堿性(pKa)、溶解性——提取性質(zhì)揮發(fā)性——揮發(fā)損失及氣相色譜法的應(yīng)用光譜特性——分析儀器的選擇官能團(tuán)性質(zhì)——化學(xué)衍生化和檢測(cè)器應(yīng)用化學(xué)穩(wěn)定性——處理?xiàng)l件的選擇存在形式及血漿蛋白結(jié)合率——預(yù)處理方法

2.待測(cè)藥物的濃度范圍不同藥物在體內(nèi)中濃度相差極為懸殊 ——地高辛治療血濃為1~2ng/ml ——水楊酸鹽治療血濃為20~100

g/ml 濃度大——預(yù)處理要求稍低 濃度低——樣品制備要求高3.藥物測(cè)定目的藥物測(cè)定目的不同——樣品預(yù)處理的要求不同： 急性中毒病例——要求快速鑒定所懷疑的藥物，應(yīng)在盡可能短的時(shí)間內(nèi)獲得其濃度的數(shù)據(jù)，對(duì)樣品預(yù)處理的要求可以粗放些

測(cè)定藥物及代謝物——要求使代謝物從綴合物中釋放出來(lái)并在不同pH介質(zhì)中分離獲得酸性、中性或堿性代謝物，對(duì)樣品預(yù)處理的要求全面、細(xì)致5.樣品預(yù)處理與分析技術(shù)的關(guān)系

1.分析方法特點(diǎn)(是否專屬、是否具有分離能力)2.檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)雜質(zhì)污染的耐受程度決定樣品預(yù)處理和需要凈化的程度三、生物樣品的預(yù)處理與制備技術(shù)

（一）有機(jī)破壞法

應(yīng)用——微量元素測(cè)定方法

1．濕法破壞 2．干法破壞 3．氧瓶燃燒法1.濕法破壞

常用試劑—硝酸或硝酸-高氯酸

特點(diǎn)—破壞能力強(qiáng)、反應(yīng)激烈，無(wú)機(jī)金屬離子為高價(jià)態(tài)

應(yīng)用—適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞

缺點(diǎn)—含氮雜環(huán)藥物的破壞不夠完全注意—切勿蒸干、以免爆炸樣品用量—金屬元素量10~100

g，血樣10~15ml、尿樣50ml2、干法破壞高溫爐高溫破壞應(yīng)用——適合人發(fā)樣品的破壞3.氧瓶燃燒（oxygenflaskcombustion）

特點(diǎn)——操作簡(jiǎn)單、快速、設(shè)備簡(jiǎn)單 應(yīng)用——血漿、人發(fā)中鹵素、硫、硒等

血漿：血漿1ml分次點(diǎn)于無(wú)灰濾紙上→60℃烘干→按規(guī)定折疊后固定 人發(fā)：洗凈、干燥（60℃~80℃）→剪碎→稱取0.1~0.3g置無(wú)灰濾紙中心→按規(guī)定折疊固定

（二）去除蛋白質(zhì)非破壞性生物樣品預(yù)處理的第一步可使結(jié)合型藥物釋放

1.去除蛋白后取上清液直接分析測(cè)定2.去除蛋白后取上清液經(jīng)進(jìn)一步分離純化、濃集后分析測(cè)定去除蛋白質(zhì)的方法

1.加入與水混溶的有機(jī)溶劑—蛋白質(zhì)脫水沉淀2.加入中性鹽—“鹽析”沉淀蛋白質(zhì)3.加入強(qiáng)酸—與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子(銨基)形成不溶性鹽沉淀4.加入重金屬鹽—與蛋白質(zhì)陰離子(羧基)形成不溶性鹽沉淀5.超濾法—半透膜濾除可溶性生物大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì))6.酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白質(zhì)7.加熱法—蛋白質(zhì)變性凝固1.加入與水相混溶的有機(jī)溶劑

常用有機(jī)溶劑:乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃血樣與溶劑體積比—1∶(1~3)可除去90%以上蛋白

乙腈—塊狀絮凝物、易于分離；成分損失可能性大，上清液pH為8.5~9.5甲醇—細(xì)小顆粒沉淀、不易分離；成分損失可能性小，上清液pH為8.5~9.5超速離心分離（12000r/min)—離心1~2min

2.加入中性鹽常用中性鹽—飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等試劑用量—血清與飽和硫酸銨比例為1∶2時(shí)除去90%以上的蛋白質(zhì)分離—高速(12000r/min)離心上清液pH7.0~7.73.加入強(qiáng)酸常用的強(qiáng)酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等試劑用量——血清與強(qiáng)酸比例為1∶0.6時(shí)，除去90%以上的蛋白質(zhì)分離——高速(12000r/min)離心1~2min，上清液pH0~4過(guò)量三氯醋酸——煮沸分解為氯仿和二氧化碳高氯酸——碳酸鉀、醋酸鉀或氫氧化鈉等中和后加乙醇使產(chǎn)生高氯酸鉀（鈉）沉淀4.加入含鋅鹽及銅鹽的沉淀劑

當(dāng)溶液pH高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基與金屬陽(yáng)離子形成不溶性鹽沉淀 常用沉淀劑—CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH血清與沉淀劑比例—1∶(1~3)， 分離—高速(10000r/min)離心，上清液pH分別為5.7~7.3和6.5~7.55.超濾法性質(zhì)—以多孔性半透膜(超濾膜)作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)；特點(diǎn)—無(wú)需加熱；無(wú)需添加化學(xué)試劑；無(wú)相變化；無(wú)破壞性應(yīng)用—游離藥物首選方法操作—分子量截留值在5萬(wàn)左右的超濾膜過(guò)濾可將分子量大的血漿蛋白以及結(jié)合了的藥物的血漿蛋白分離

6．酶水解法

加入適量的酶和緩沖液，置水浴上水解一定時(shí)間，過(guò)濾或離心，取上清液供萃取用 最常用的酶—蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在較寬的pH范圍(pH7.0~11.0)內(nèi)使蛋白的肽鍵降解，在50~60℃具有最大活力7.

加熱法

測(cè)定對(duì)熱穩(wěn)定性好的組分時(shí)，可采用加熱的方法將一些熱變性蛋白沉淀 加熱溫度視欲測(cè)組分的熱穩(wěn)定性而定，通常可加熱到90℃；蛋白沉淀后可用離心或過(guò)濾除去 優(yōu)點(diǎn)——方法最簡(jiǎn)單 缺點(diǎn)——只能除去熱變性蛋白（三）溶劑提取溶劑選擇—合適的溶劑是成功的主要條件①了解藥物與溶劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)—相似相溶的原則②對(duì)藥物未電離分子可溶，電離形式分子不溶③沸點(diǎn)低、易揮散，毒性小與水不相混溶④不影響紫外檢測(cè)⑤具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性有機(jī)溶劑萃取次數(shù)—通常為1次，必要時(shí)2~3次有機(jī)溶劑每次用量—與水相體積比通常為1:1或2~5:1通過(guò)萃取回收率確定最佳萃取次數(shù)與每次的溶劑用量水相pH值:

由藥物的pKa確定堿性藥物最佳pH值高于