從基因到蛋白質(zhì)

從基因到蛋白質(zhì)

--生物基因的表達(dá)及調(diào)控蘇川chuansu@南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系86862774江蘇省病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室86862773一、基因表達(dá)的概述：從基因到蛋白質(zhì)――中心法則：

DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制二、基因表達(dá)調(diào)控的基本概念與原理：基因表達(dá)調(diào)控的概念及方式：基因：一個(gè)遺傳單位，是一段可表達(dá)的DNA序列。基因組：一個(gè)單倍體細(xì)胞或病毒顆粒的全套基因。人類基因組含約4萬(wàn)個(gè)基因?；虮磉_(dá)：基因所包含的遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄生成RNA，再經(jīng)過(guò)翻譯生成蛋白質(zhì)的過(guò)程。一般而言，在某一特定時(shí)刻，高等生物僅有不到15%的基因表達(dá)?；虮磉_(dá)調(diào)控：基因表達(dá)有其特定的規(guī)律，并受到機(jī)體各種因素的調(diào)節(jié)和控制。對(duì)基因的表達(dá)實(shí)施精確的控制，使細(xì)胞適應(yīng)不同階段、不同環(huán)境條件下的生長(zhǎng)與發(fā)育的需要，維持機(jī)體正常生命活動(dòng)，有著重要意義。可誘導(dǎo)基因：基因表達(dá)的時(shí)間特異性基因表達(dá)的空間特異性（組織特異性）看家基因:2.基因表達(dá)調(diào)控的基本原理：原核生物和真核生物的基因表達(dá)調(diào)控盡管在細(xì)節(jié)上差異很大，但兩者的調(diào)控模式和原理極為相似。調(diào)節(jié)作用主要包括核酸之間的相互作用、核酸與蛋白質(zhì)之間的相互作用以及蛋白質(zhì)之間的相互作用。調(diào)控作用可能是正向的或負(fù)向的。調(diào)控點(diǎn)可以位于基因表達(dá)過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，如基因的激活、轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工、mRNA降解、蛋白質(zhì)翻譯、翻譯后加工和蛋白質(zhì)降解等。特異DNA序列對(duì)基因表達(dá)的影響：真（原）核生物DNA分子上的特定序列構(gòu)成了基因表達(dá)的基本信號(hào)：起始密碼、調(diào)控序列、編碼序列、終止密碼、單拷貝序列、重復(fù)序列等。DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用對(duì)基因表達(dá)的影響：DNA上的特定序列可以與相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合，這些蛋白質(zhì)依其作用分為：阻遏蛋白（repressor）：與操縱序列結(jié)合，阻遏基因的轉(zhuǎn)錄。激活蛋白（activator）：與啟動(dòng)子中的特定序列結(jié)合，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。特異因子轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor,TF）也稱反式作用因子（trans-actingfactor）：通過(guò)與順式作用元件結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性DNA-蛋白質(zhì)之間的結(jié)合通常是非共價(jià)鍵的形式，通過(guò)蛋白質(zhì)分子中特殊的結(jié)構(gòu)域與DNA分子中雙螺旋結(jié)構(gòu)的大溝結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。常見(jiàn)的DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合域有：螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋（helix-turn-helix）鋅指（zincfingers）蛋白質(zhì)之間相互作用對(duì)基因表達(dá)的影響：調(diào)節(jié)蛋白通常通過(guò)二聚體（dimer）或多聚體（polymer）的形式與DNA結(jié)合不同的調(diào)節(jié)蛋白也可以相互作用或結(jié)合后，再與DNA特定部位結(jié)合，調(diào)節(jié)同一基因的不同轉(zhuǎn)錄水平，尤其多見(jiàn)于真核生物。蛋白質(zhì)之間相互作用的典型特征包括：亮氨酸拉鏈（leucinezipper）螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋（helix-loop-helix）RNA聚合酶對(duì)基因表達(dá)的影響：轉(zhuǎn)錄起始是通過(guò)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的，轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控中最重要、最基礎(chǔ)的調(diào)控點(diǎn)之一。不同啟動(dòng)子的序列不同，因而影響它們與RNA聚合酶結(jié)合的親和力，親和力的不同繼而直接影響轉(zhuǎn)錄起始的頻率。RNA聚合酶和啟動(dòng)子的結(jié)合也會(huì)受到調(diào)節(jié)蛋白的影響,阻遏蛋白、激活蛋白、特異因子、轉(zhuǎn)錄因子等均可通過(guò)增強(qiáng)或者干擾DNA聚合酶與啟動(dòng)子之間的結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的起始。三、原核生物的基因表達(dá)調(diào)控：

原核生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、無(wú)細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程耦聯(lián)在一起，對(duì)環(huán)境條件的變化反應(yīng)迅速，可以根據(jù)環(huán)境因素的變化迅速調(diào)整自身基因的表達(dá)，滿足其生長(zhǎng)和繁殖的需要。原核基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)為：普遍存在操縱子調(diào)控模式通過(guò)特異的阻遏蛋白或激活蛋白調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄與翻譯的耦聯(lián)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：乳糖操縱子的調(diào)控：阻遏蛋白對(duì)乳糖操縱子的調(diào)節(jié)2）其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制：轉(zhuǎn)錄衰減：基因重組：翻譯水平的調(diào)控：SD序列對(duì)翻譯的影響：SD序列是原核生物mRNA起始密碼子AUG上游3-10堿基的由3-9個(gè)堿基組成的一個(gè)富含嘌呤核苷酸的序列，能與核糖體小亞基16srRNA3’末端富含嘧啶的序列互補(bǔ)，從而使核糖體與mRNA結(jié)合，開(kāi)始翻譯。mRNA的穩(wěn)定性：原核細(xì)胞內(nèi)mRNA通常很快被降解。例如：E.coli的許多mRNA在37℃時(shí)的平均壽命只有大約2分鐘。翻譯產(chǎn)物對(duì)翻譯的影響：有些mRNA編碼的蛋白質(zhì)，本身就是在蛋白翻譯過(guò)程中發(fā)揮作用的因子。這些因子可對(duì)自身的翻譯產(chǎn)生調(diào)控作用。如起始因子3（IF-3），當(dāng)它合成過(guò)多時(shí)，能有效地校正和抑制其自身的起始密碼子與起始tRNA的配對(duì)而抑制翻譯的起始。另外還有核糖體蛋白、翻譯終止因子等均可影響翻譯過(guò)程。四、真核生物的基因表達(dá)調(diào)控：真核生物基因表達(dá)調(diào)控與原核不同點(diǎn)在于：轉(zhuǎn)錄激活與染色體轉(zhuǎn)錄區(qū)特定結(jié)構(gòu)相適應(yīng)正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄與翻譯在空間上的分離更多、更復(fù)雜的調(diào)控蛋白（一）、DNA水平的調(diào)控（真核生物表達(dá)調(diào)控的次要和輔助手段）：染色質(zhì)（chromatin）結(jié)構(gòu)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用： 真核基因通常與組蛋白（histone）結(jié)合形成核小體，從而保護(hù)DNA免受損傷，維持基因組穩(wěn)定，抑制基因的表達(dá)。影響基因表達(dá)水平的主要有：組蛋白的含量組蛋白的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白與組蛋白H1和H5竟?fàn)幒虳NA的結(jié)合，從而解除組蛋白對(duì)基因表達(dá)的抑制作用?；蛐揎棇?duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用： 胞嘧啶經(jīng)甲基化為5-甲基胞嘧啶（常出現(xiàn)在5’端側(cè)翼序列的GC豐富區(qū)），影響DNA特異序列與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，使基因不能轉(zhuǎn)錄或阻止轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成?；騺G失：在細(xì)胞分化過(guò)程中，可以通過(guò)丟失掉某些基因而去除掉某些基因的活性。染色體破碎所致的不均等分配。僅發(fā)生在低等生物中（原生動(dòng)物、線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、甲殼類動(dòng)物等），此現(xiàn)象在高等生物中迄今尚未發(fā)現(xiàn)。基因擴(kuò)增：細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專一性地大量增加的現(xiàn)象，它是細(xì)胞在短期內(nèi)為滿足某種需要（發(fā)育需要、外界環(huán)境因素）而產(chǎn)生足夠的基因產(chǎn)物的一種調(diào)控手段?；蛑嘏牛?/p>

基因重排是指某些基因片段改變?cè)瓉?lái)的存在順序，通過(guò)調(diào)整有關(guān)基因片段的銜接順序，重新組成為一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位。一種熟知的以基因重排來(lái)調(diào)節(jié)不同基因表達(dá)的例子是哺乳動(dòng)物免疫球蛋白各編碼區(qū)的連接：一個(gè)免疫球蛋白分子包括兩條相同的輕鏈和重鏈。輕鏈：可變區(qū)、恒定區(qū)、連接區(qū)都由位于同一染色體不同位置的DNA片段編碼，在形成活性基因前，上述各一個(gè)基因通過(guò)染色體內(nèi)重組成連到一起。重鏈：可變區(qū)、恒定區(qū)、連接區(qū)、歧化區(qū)（二）、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控：

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是真核基因表達(dá)調(diào)控中最重要的環(huán)節(jié)，大多數(shù)生物基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是決定細(xì)胞質(zhì)中mRNA水平的一個(gè)最重要方式，調(diào)控主要通過(guò)反式作用因子和RNA聚合酶的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。反式作用因子是一類細(xì)胞核內(nèi)存在的蛋白質(zhì)，是與特異的DNA序列（順式作用元件）結(jié)合的調(diào)控蛋白。它通過(guò)識(shí)別并結(jié)合上游啟動(dòng)子元件和增強(qiáng)子中的順式元件，激活或阻遏基因的表達(dá)。它包括三個(gè)功能域：DNA識(shí)別結(jié)合域（常有鋅指結(jié)構(gòu)）轉(zhuǎn)錄活性域（富含某些特定氨基酸如谷氨酰氨）蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域（常具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和螺旋－環(huán)－螺旋結(jié)構(gòu)等）。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:

轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過(guò)程有三步：TATA因子結(jié)合TATA盒（形成TATA因子－DNA復(fù)合物）RNApol識(shí)別并結(jié)合TATA因子－DNA復(fù)合物（閉合復(fù)合物，DNA雙鏈沒(méi)有打開(kāi)，不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄）轉(zhuǎn)錄起始因子與RNApol結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物（開(kāi)放復(fù)合物，DNA雙螺旋已打開(kāi)，可以合成RNA）轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控：

基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控主要通過(guò)反式作用因子、順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用來(lái)完成。調(diào)控機(jī)制涉及反式作用因子的激活及反式作用因子的作用等。反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：表達(dá)調(diào)節(jié)：迅速合成、迅速降解共價(jià)修飾：磷酸化－去磷酸化、糖基化配體結(jié)合：激素－激素受體（是核內(nèi)的反式作用因子）蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用：max蛋白－c-myc蛋白（核內(nèi)的反式作用因子）反式作用因子與順式元件結(jié)合的調(diào)節(jié)：順式作用元件包括：上游啟動(dòng)子元件遠(yuǎn)距離的增強(qiáng)子元件（上游增強(qiáng)子元件、下游增強(qiáng)子元件）反式作用因子作用方式的調(diào)節(jié)： 反式作用因子通過(guò)下列不同的方式作用到RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)從而影響其轉(zhuǎn)錄活性：成環(huán)扭曲滑動(dòng)連鎖反應(yīng)反式作用因子的組合式調(diào)節(jié)： 幾種不同的反式作用因子組合，發(fā)揮特定的作用。（三）、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控： 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控一般是指基因轉(zhuǎn)錄后對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行一系列修飾、加工過(guò)程，主要包括mRNA選擇性剪切、胞內(nèi)定位以及mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)：DNA（核內(nèi)）

轉(zhuǎn)錄

mRNA前體

加工成熟mRNA

運(yùn)輸細(xì)胞質(zhì)

mRNA前體加帽、加尾以調(diào)控其穩(wěn)定性：5’加帽（capping）：7－甲基鳥(niǎo)苷三磷酸3’端加尾（tailing）：多聚A（PolyA）mRNA前體的選擇性剪接（splicing）與拼接：選擇性剪切：去除mRNA前體中的內(nèi)含子選擇性拼接：從同一基因產(chǎn)生若干種有部分相同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，即通過(guò)Mrnau前性的選擇性拼接而產(chǎn)生不同的成熟mRNA，然后翻譯成不同的蛋白質(zhì)。選擇性表達(dá)：多基因的基因家族中的各成員在特定的細(xì)胞中，在一定的發(fā)育階段和在一定的生理?xiàng)l件下選擇性的表達(dá)。RNA編輯的調(diào)控：

RNA編輯（editing）：是指轉(zhuǎn)錄后的mRNA前體在編碼區(qū)發(fā)生核苷酸改變的現(xiàn)象，從而產(chǎn)生出氨基酸序列不同的蛋白質(zhì)。包括：核苷酸的替換核苷酸的插入或缺失mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控：mRNA前體經(jīng)過(guò)加帽、加尾、剪切等加工后通過(guò)核膜孔從核內(nèi)運(yùn)至胞漿。大約只有20%的mRNA進(jìn)入胞漿，留在核內(nèi)的mRNA約50%會(huì)在1小時(shí)內(nèi)降解。（四）、翻譯水平的調(diào)控：

翻譯水平的調(diào)控主要是控制mRNA的穩(wěn)定性和mRNA翻譯的起始頻率，是一種迅速控制基因表達(dá)的方式，是各種高等生物廣泛采用的調(diào)控方式。mRNA的穩(wěn)定性，取決于：mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（不易受外切酶攻擊）帽子及其種類polyA尾的長(zhǎng)短與mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)的種類mRNA翻譯起始的調(diào)控（即控制mRNA的可翻譯性）：許多蛋白質(zhì)因子可以影響蛋白質(zhì)合成的起始，如真核生物起始因子－2（eukaryoticinitiationfactor，eIF-2）的磷酸化會(huì)使其活性降低，從而減少蛋白質(zhì)合成。Recruitmentfactor可使maskedmRNA與核糖體、氨?；?tRNA、蛋白質(zhì)結(jié)合。真核生物蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控： 某些蛋白可抑制其自身mRNA的翻譯（五）、翻譯后水平的調(diào)控： mRNA翻譯的產(chǎn)物－－新生多肽鏈大多是沒(méi)有生物學(xué)流行性的，必須經(jīng)過(guò)加工、修飾才能成為有流行性的蛋白質(zhì)，加工、修飾過(guò)程包括：信號(hào)肽的切除：由15－30個(gè)疏水氨基酸組成的信號(hào)肽可使蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入高爾基體。新生肽鏈的修飾：磷酸化、羥基化、糖基化、乙酰化等。肽鏈的剪切與正確折疊五、蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)蛋白質(zhì)的檢測(cè)：SDS－PAGE與WesternblotELISA蛋白質(zhì)芯片mRNA的檢測(cè)：NorthernblotRT-PCRNucleirun-on基因芯片DNA的檢測(cè)：PCRSouthernblotDNA測(cè)序SDS－PAGE與Westernblot原理：確保蛋白質(zhì)解離為單個(gè)多肽亞基（SDS）通過(guò)分離膠的篩分作用，將蛋白質(zhì)多肽按分子量的大小不同得到分離將蛋白質(zhì)固定于尼龍膜上以抗體識(shí)別待檢蛋白（抗原）固定物1Ab2AbE蛋白質(zhì)（抗原）2.操作過(guò)程樣品制備：收集細(xì)胞PBS洗滌并離心沉淀細(xì)胞加入適量細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，置冰上30分鐘高速離心，取上清（蛋白溶液）加入等量2XSDS－PAGE樣品緩沖液煮沸5分鐘后上樣（或保存于－20℃）制膠（不連續(xù)緩沖膠系統(tǒng)）：膠的成份：壓縮膠分離膠膠濃度的選擇：丙烯酰氨濃度蛋白線性分離范圍/KDa1512107.5510－4312－6020－8036－9457－212加樣與電泳：加適量的樣品（200－1000ug總蛋白量）、對(duì)照及蛋白分子量marker180－200volts電泳直到溴酚藍(lán)跑出凝膠（Bio-Rad電泳裝置）凝膠染色：考馬斯亮藍(lán)（R－250）染色銀染印跡轉(zhuǎn)移：原理：帶正電荷的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)作用下從負(fù)極（凝膠）向正極（尼龍膜或硝纖膜）遷移，蛋白質(zhì)通過(guò)疏水作用結(jié)合到膜上4℃條件下，300mA電泳1－3小時(shí)（Bio-Rad電泳裝置）封閉：5%脫脂牛奶或5%BSA，室溫下1小時(shí)（或4℃過(guò)夜）一抗反應(yīng)：選擇合適的第一抗體適量抗體以5%脫脂牛奶或5%BSA稀釋室溫下1小時(shí)（或4℃過(guò)夜）反應(yīng)二抗反應(yīng)：選擇合適的酶標(biāo)第二抗（第一抗體）體適量抗體以5%脫脂牛奶或5%BSA稀釋室溫下1小時(shí)（或4℃過(guò)夜）反應(yīng)加生色底物顯色HRP的底物：生色：4－氯－1－萘酚/H2O2發(fā)光：ECL溶液（魯米諾/4－碘代酚/H2O2）AP的底物：生色：氮藍(lán)四唑/5－溴－4氯吲哚磷酸發(fā)光：AMPPD拍