第19章 遺傳信息傳遞的整體性(段秋紅)

第十九章遺傳信息傳遞的整體性

Integrationofexpressionandtransmissionofgeneticinformation第一節(jié)基因組學Genomics

一、基因組就是一種生物擁有的所有遺傳信息的總合是一個細胞（或病毒）所載的全部遺傳信息，它代表了一種生物所具有的全部遺傳信息。真核生物基因組是指一套完整單倍體DNA（染色體DNA）及線粒體或葉綠體DNA的全部序列，既有編碼序列，也有大量存在的非編碼序列。細菌基因組包含了擬核和質粒中的DNA序列。病毒基因組有的為DNA（DNA病毒），有的則為RNA（RNA病毒）。*基因組（genome）二、基因組學包括結構基因組學、功能基因組學和比較基因組學1.基因組學（genomics）是闡明整個基因組的結構、結構與功能的關系以及基因之間相互作用的科學。2.研究內容結構基因組學（structuralgenomics）:

遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜以及轉錄圖譜和大規(guī)模DNA測序。功能基因組學（functionalgenomics）:分析鑒定基因組功能。比較基因組學（comparativegenomics）：基因組之間比較鑒定，研究生物進化，預測新基因。三、結構基因組學的主要任務是基因組作圖和大規(guī)模測序

通過基因作圖、構建連續(xù)克隆系及大規(guī)模測序等方法，結合主要模式生物已知基因組DNA序列，輔以生物信息學和計算生物學技術，解密人類基因組DNA序列和結構。人類基因組計劃（HumanGenomeProject，HGP）：1．遺傳作圖2．物理作圖（一）遺傳作圖和物理作圖是繪制人類基因組草圖的重要策略染色體DNA很長，不能直接進行測序，必須先將基因組DNA進行分解、標記，使之成為可操作的較小結構區(qū)域，這一過程稱為作圖。

遺傳作圖（geneticmapping）:就是確定連鎖的遺傳標志位點在一條染色體上的排列順序及它們之間的相對遺傳距離，用厘摩爾根（centi-Morgan，cM）表示，當兩個遺傳標記之間的重組值為1%時，圖距即為1cM。1．遺傳作圖就是繪制連鎖圖遺傳圖(geneticmap)又稱連鎖圖(linkagemap)。*DNA標記①限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）②可變數(shù)目串聯(lián)重復序列（variablenumberoftandemrepeat，VNTR）③單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）①限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）：利用特定的限制性內切酶識別并切割基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，所產(chǎn)生的DNA數(shù)目和各個片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布情況。②可變數(shù)目串聯(lián)重復序列（VNTR）：又稱微衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA），是一種重復DNA短序列。VNTR基本原理與RFLP大致相同，通過限制性內切酶的酶切和DNA探針雜交，可一次性檢測到眾多微衛(wèi)星位點，得到個體特異性的DNA指紋圖譜。③單核苷酸多態(tài)性（SNP）：

SNP不以“長度”的差異作為檢測手段，而是直接以序列的變異作為標記。SNP是指在基因組水平上由單個核苷酸變異所造成的DNA序列多態(tài)性。SNP是人類可遺傳的變異中最常見的一種，也是基因組中最為穩(wěn)定的變異。SNP最大限度地代表了不同個體之間的遺傳差異，因而成為研究多基因疾病、藥物遺傳學及人類進化的重要遺傳標記。

物理作圖（physicalmapping）是在遺傳作圖基礎上制作的更詳細的人類基因組圖譜。包括：

熒光原位雜交圖（FISHmap）限制性酶切圖（restrictionmap）連續(xù)克隆系圖（clonecontigmap）2．物理作圖就是描繪雜交圖、限制性酶切圖及克隆系圖①熒光原位雜交圖（fluorescentinsituhybridizationmap，F(xiàn)ISHmap）：將熒光標記的探針與染色體雜交確定分子標記所在的位置。②限制性酶切圖（restrictionmap）：將限制性酶切位點標定在DNA分子的相對位置。③連續(xù)克隆系圖（clonecontigmap）：采用酶切位點稀有的限制性內切酶或高頻超聲破碎技術將DNA分解成大片段后，再通過構建酵母人工染色體（yeastartificialchromosome，YAC）或細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）獲取含已知基因組序列標簽位點（sequencetaggedsite，STS）的DNA大片段。*STS（sequencetaggedsite，基因組序列標簽位點）：是指染色體定位明確，并且可用PCR擴增的單拷貝序列，每隔100kb距離就有一個標志。在STS基礎上構建能夠覆蓋每條染色體的大片段DNA連續(xù)克隆系就可繪制精細物理圖譜，為大規(guī)模DNA測序做好了準備。（二）通過BAC克隆系、鳥槍法等完成大規(guī)模DNA測序1．BAC克隆系的構建是大規(guī)模DNA測序的基礎

YAC載體裝載量偏大（1

2Mb），自身穩(wěn)定性不夠。

BAC具有插入片段較大（幾kb

350kb）、嵌合率低、遺傳穩(wěn)定性好、易于操作等優(yōu)點。2．鳥槍法是大規(guī)模DNA測序的重要方法全基因組鳥槍法測序（shotgunsequencing）

直接將整個基因組打成不同大小的DNA片段，構建BAC文庫，然后對文庫進行隨機測序，最后運用生物信息學方法將測序片段拼接成全基因組序列。鳥槍法DNA測序的主要步驟：①建立高度隨機、插入片段大小為1.6kb到4kb左右的基因組文庫。②高效、大規(guī)模的克隆雙向測序。③序列組裝（sequenceassembly）產(chǎn)生一定數(shù)量的重疊群（contig）。④缺口填補。

鳥槍法（shotgun）測序的的原理與策略3．高通量測序技術大大加快了基因組DNA

測序的進行高通量測序（high-throughputsequencing）技術：不僅具備毛細管電泳測序不具備的優(yōu)點，還能進行“平行/多點”、“單分子”和“混合”序列分析。這種高通量測序一次實驗可以讀取幾十萬到幾百萬DNA片段的序列，極大加速了基因組測序。（三）生物信息學是預測基因組結構和功能的重要手段數(shù)據(jù)庫的建設：匯集了大量DNA序列、蛋白質信息預測基因、基因產(chǎn)物的結構、功能；分析基因-基因、基因-產(chǎn)物、產(chǎn)物-產(chǎn)物之間的相互作用或聯(lián)系；描述細胞或整體水平的基因表達譜；推測系統(tǒng)發(fā)生關系。主要的生物信息中心美國國家生物技術信息中心（NCBI，）歐洲生物信息研究所（EBI，http://ebi.ac.uk）日本DNA數(shù)據(jù)庫（DDBJ，http://www.ddbj.nig.ac.jp）GenBank（/Genbank）四、功能基因組學系統(tǒng)探討基因的

活動規(guī)律功能基因組學：從整體水平上研究一種組織或細胞在同一時間或同一條件下所表達基因的種類、數(shù)量、功能及在基因組中的定位，或同一細胞在不同狀態(tài)下基因表達的差異。主要研究內容包括基因組的表達基因組功能注釋基因組表達調控網(wǎng)絡及機制（一）通過全基因組掃描鑒定DNA序列中的基因

對測得的基因組序列進行“注釋”，包括鑒定和描述推測的編碼序列、非編碼序列及其功能。技術支持：人類基因組DNA序列數(shù)據(jù)庫；高性能計算機。改進的十進制計算機進行全基因組掃描，鑒定內含子與外顯子之間的銜接，尋找全長ORFs，確定多肽鏈編碼序列。同源基因：在進化過程來自共同的祖先的基因，通過核苷酸或氨基酸序列的同源性比較，可以推測基因組內相似基因的功能。有效工具：NCBI的序列局部相似性查詢（BasicLocalAlignmentSearch，BLAST）程序。操作流程：GenBank中查找基因序列訪問號碼（accessionnumber），在BLAST界面上輸入2條或多條訪問號碼，就可實現(xiàn)兩兩或多對序列的比對。（二）通過BLAST等程序搜索同源基因

（三）通過實驗設計驗證基因功能

轉基因（transgene）基因過表達（overexpression）基因敲除（knock-out）基因敲減（knock-down）或基因沉默（genesilencing）合適的模式生物替代人體進行實驗（四）通過轉錄組和蛋白質組描述基因表達模式基因表達：RNA的轉錄和蛋白質的翻譯基因的表達模式及調控描述：借助轉錄組學和蛋白質組學相關技術與方法第二節(jié)

轉錄組學

Transcriptomics一、轉錄組學研究全部RNA的表達及功能轉錄組（transcriptome）指生命單元（通常是一種細胞）所能轉錄出來的所有RNA——包括指導蛋白質翻譯的mRNA和非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA)的總和。RNA功能基因組學，又稱RNA組學（RNomics）：是分析、鑒定非信使小RNA（smallnon-messengerRNA,snmRNA）在特定狀態(tài)下表達差異、功能及其與蛋白質的相互作用。轉錄組學（transcriptomics）：是在整體水平上研究細胞編碼基因轉錄情況及轉錄調控規(guī)律的科學。轉錄組的特點：受到內外多種因素的調節(jié)，因而是動態(tài)可變的。能夠揭示不同物種、不同個體、不同細胞、不同發(fā)育階段及不同生理病理狀態(tài)下的基因差異表達信息。二、轉錄組學的核心工作是分析基因表達譜大規(guī)模表達譜或全景式表達譜（globalexpressionprofile）：是生物體（組織、細胞）在某一狀態(tài)下基因表達的整體狀況?；蚬δ艿难芯糠椒ǎ夯虻牟町惐磉_方法；基因表達譜芯片（cDNA芯片、EST芯片等）。（一）采用cDNA芯片可實現(xiàn)大規(guī)模已知（序列）基因表達譜分析（二）SAGE和MPSS分析可鑒定未知/新基因表達信息基因表達系列分析（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）和大規(guī)模平行信號測序系統(tǒng)（massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS）可實現(xiàn)基因表達譜芯片很難檢測某些特定時段表達或表達水平較低的基因或未知基因的表達。（三）推斷未知基因功能，探索生命機制轉錄組分析可以提供特定條件下（生理、病理、誘導刺激等）基因表達的信息，通過使用基因堿基序列數(shù)據(jù)和比較已知及未知功能的基因，推斷相應未知基因的功能，揭示特定調節(jié)基因的作用機制。三、芯片、SAGE和MPSS是轉錄組學研究主要技術轉錄組學研究重點：基因轉錄的區(qū)域轉錄因子結合位點染色質修飾點DNA甲基化位點等研究技術：微陣列（microarray）SAGEMPSS（一）微陣列是大規(guī)?；蚪M表達譜研究的

主要技術微陣列或基因芯片（DNAchip）原理利用光導化學合成、照相平板印刷以及固相表面化學合成等技術，在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸探針，并與放射性同位素或熒光物標記的來自不同細胞、組織或整個器官的DNA或mRNA反轉錄生成的第一鏈cDNA進行雜交，然后用特殊的檢測系統(tǒng)對每個雜交點進行定量分析。優(yōu)點：可同時對大量基因，甚至整個基因組的基因表達進行對比分析。微陣列技術的基本步驟（二）SAGE在轉錄物水平研究細胞或

組織基因表達模式SAGE的基本原理：用來自cDNA3‘端特定位置9～10bp長度的序列所含有的足夠信息鑒定基因組中的所有基因利用錨定酶（anchoringenzyme，AE）和位標酶（taggingenzyme，TE）切割DNA分子的特定位置（靠近3’端），分離SAGE標簽，并將這些標簽串聯(lián)起來，然后對其進行測序特點：可全面提供生物體基因表達譜信息可用來定量比較不同狀態(tài)下組織或細胞的所有差異表達基因（三）MPSS是以基因測序為基礎的

基因表達譜分析新技術MPSS的原理：一個含有能夠特異識別轉錄子的信息標簽序列（10～20bp）與長的連續(xù)分子連接在一起，測出mRNA的一端包含一個10至20個堿基的標簽序列。每一標簽序列在樣品中的頻率（拷貝數(shù)）代表了與該標簽序列相應的基因表達水平。基因表達水平是以計算mRNA拷貝數(shù)為基礎，是一個數(shù)字表達系統(tǒng)。只要將病理和對照樣品分別進行測定，即可進行嚴格的統(tǒng)計檢驗，能測定表達水平較低、差異較小的基因，而且不必預先知道基因的序列。四、RNA組學研究全部非mRNA小RNA的集合人類基因組序列特點：2萬

2.5萬個基因，與蛋白質合成有關的序列占整個基因組的2%左右，其余98%的基因組序列沒有得到注釋。RNA組學研究范疇：小分子RNA，包括

snRNA、snoRNA、scRNA、催化性小RNA（smallcatalyticRNA）、小片段干涉RNA（smallinterferingRNA，siRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）第三節(jié)蛋白質組學Proteomics

以細胞、組織或機體在特定時間和空間上表達的所有蛋白質即蛋白質組（proteome）為研究對象，分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質之間的相互作用與聯(lián)系，并在整體水平上研究蛋白質調控的活動規(guī)律，故又稱為全景式蛋白質表達譜（globalproteinexpressionprofile）分析。蛋白質組學（proteomics）與蛋白質組研究相關的數(shù)據(jù)庫蛋白序列數(shù)據(jù)庫（SWISS-PROT/TrEMBL；http://www.expasy.ch）基因序列數(shù)據(jù)庫（Genbank，/EMBL；http://www.ebi.ac.uk/）蛋白模式數(shù)據(jù)庫（Prosite；http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋白質二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫、蛋白三維結構數(shù)據(jù)庫（PDB，/；FSSP，http://www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫（O-GLYCBASE，http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）一、研究細胞內所有蛋白質組成及其

活動規(guī)律是蛋白質組學的中心任務蛋白質組學的研究內容：一是蛋白質組表達模式的研究，即結構蛋白質組學（structuralproteomics）二是蛋白質組功能模式的研究，即功能蛋白質組學（functionalproteomics）蛋白質組學的主要任務