側(cè)柏葉總黃酮的質(zhì)量控制

側(cè)柏葉總黃酮的質(zhì)量控制

側(cè)柏葉是柏樹科的一種干燥的側(cè)柏葉。其性味苦澀、性寒,具有涼血止血、鎮(zhèn)咳、平喘和殺菌等作用。其中的黃酮類成分被認(rèn)為是側(cè)柏葉的主要有效成分之一。目前側(cè)柏葉總黃酮提取物在醫(yī)藥品、保健用品和保健食品領(lǐng)域中的應(yīng)用廣泛。最近研究證實(shí),側(cè)柏葉總黃酮具有α-糖苷酶抑制劑作用,是很有前途的Ⅱ型糖尿病降糖新藥。前期試驗(yàn)對(duì)側(cè)柏葉中總黃酮進(jìn)行提取純化工藝研究,并確定了“側(cè)柏黃酮”的提取工藝。筆者主要對(duì)“側(cè)柏黃酮”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究,以期為側(cè)柏葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1研究的對(duì)象側(cè)柏葉,購(gòu)自長(zhǎng)春市宏檢藥材公司。1.1.2主要設(shè)備UV-1701紫外可見分光光度計(jì)和SHIMADZU2010高效液相色譜儀,均購(gòu)自日本島津公司。1.1.3水和水質(zhì)組成槲皮苷對(duì)照品,購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所;甲醇為色譜純,購(gòu)自美國(guó)Fisher公司;水為純凈水,購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司;穗花杉雙黃酮對(duì)照品,自制,面積歸一化法計(jì)算其純度為99.64%,批號(hào)20080701;其他試劑為分析純,購(gòu)自北京化工廠。1.2方法1.2.1黃酮的總含量1.2.1.1.對(duì)照溶液的制備取槲皮苷對(duì)照品,精密稱定,加無水甲醇制成濃度為0.1mg/ml的對(duì)照品溶液。1.2.1.2.樣品溶液的制備稱取側(cè)柏葉總黃酮50mg,至50ml量瓶中,加無水甲醇溶解,定溶至刻度,搖勻?yàn)V過,取續(xù)濾液即得。1.2.1.3.選擇探測(cè)波長(zhǎng)槲皮苷對(duì)照品溶液經(jīng)顯色后,進(jìn)行紫外掃描,在200～400nm進(jìn)行紫外掃描,選擇最佳測(cè)定波長(zhǎng)。1.2.1.方法的回歸方程①線性關(guān)系的考察。分別吸取不同濃度的槲皮苷對(duì)照品溶液,顯色后,在428nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,計(jì)算回歸方程。②精密度的考察。取樣品溶液顯色后連續(xù)進(jìn)行7次測(cè)定,記錄吸光度值,以吸光度值計(jì)算RSD。③穩(wěn)定性的考察。取樣品溶液顯色后,分別于0、10、20和30min處測(cè)定,記錄吸收值,計(jì)算其RSD。④重現(xiàn)性考察。對(duì)同1批樣品,獨(dú)立進(jìn)行6次測(cè)定,計(jì)算其RSD。⑤回收率試驗(yàn)。取已知含量樣品6份,加入對(duì)照品適量,計(jì)算其平均回收率和RSD。1.2.1.含量測(cè)定和測(cè)定總氮的測(cè)定精密量取對(duì)照品溶液及供試品溶液各1ml,分別放入10ml容量瓶中,加入1ml濃度10%的三氯化鋁甲醇溶液,用無水甲醇定容至刻度,搖勻后于428nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,并計(jì)算含量。1.2.2測(cè)定了綏化山維斯黃酮的含量1.2.2.流動(dòng)相、柱溫度色譜柱為AgelaC18(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相為無水甲醇-水(60∶40,V/V);流速為1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm;柱溫為30℃;進(jìn)樣量為10μl。1.2.2.對(duì)照品溶液的制備取穗花杉雙黃酮對(duì)照品,精密稱定,加無水甲醇制成濃度為0.5mg/ml的對(duì)照品溶液,取1ml置10ml容量瓶中加無水甲醇定溶至刻度,得濃度為0.05mg/ml的對(duì)照品溶液。1.2.2.供試品溶液制備取40mg側(cè)柏葉總黃酮,置50ml容量瓶中,加無水甲醇適量,超聲處理10min,并用無水甲醇定容至刻度,搖勻,再吸取1ml置10ml容量瓶中,加無水甲醇定溶至刻度,搖勻?yàn)V過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。1.2.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制①專屬性考察。取溶劑甲醇作為陰性對(duì)照溶液,在以上條件下,分別進(jìn)樣穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液,進(jìn)行專屬性試驗(yàn)。②線性關(guān)系的考察。分別吸取濃度為0.5mg/ml的對(duì)照品溶液各2.5、2.0、1.5和1.0ml,分別置10ml量瓶中,加無水甲醇至刻度,依次得到A、B、C和D,從D中吸取5ml至10ml量瓶,加無水甲醇定溶得E,再?gòu)腅中吸取5ml至10ml量瓶,加無水甲醇定溶得F,吸取上述對(duì)照品溶液各10μl,分別注入液相色譜儀測(cè)定,記錄色譜圖,測(cè)定其峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),穗花杉雙黃酮進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算回歸方程。③重復(fù)性考察。對(duì)同1批樣品照供試品制備方法操作,獨(dú)立進(jìn)行6次測(cè)定,計(jì)算RSD。④精密度的考察。取樣品40mg,按供試品制備方法,分別于0、2、4、8、12、24和48h依法測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算RSD。⑤回收率試驗(yàn)。取同1批樣品6份,每份20mg,置50ml容量瓶中,精密加入濃度為1.001mg/ml的穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液10ml,按按供試品制備方法操作,得供試品溶液,測(cè)定,計(jì)算其平均回收率和RSD。1.2.3測(cè)量值對(duì)3批樣品中總黃酮含量和穗花杉雙黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。2結(jié)果與分析2.1黃酮的總含量2.1.1測(cè)量波長(zhǎng)的選擇計(jì)算得在波長(zhǎng)428nm為有最大吸收,故選擇該波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。2.1.2方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性①線性關(guān)系的考察。計(jì)算得回歸方程為Y=62.25X+0.0186(R=0.9993)。試驗(yàn)結(jié)果表明,在0.00208～0.0208mg/ml范圍內(nèi)槲皮苷濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。②精密度的考察。計(jì)算得吸光度的RSD為0.85%,表明該法重復(fù)性良好,方法穩(wěn)定、可行。③穩(wěn)定性的考察。計(jì)算得吸收值的RSD為0.73%,表明在30min內(nèi),供試品溶液穩(wěn)定性良好。④重現(xiàn)性考察。計(jì)算得吸收值的RSD為1.69%,表明方法重現(xiàn)性良好。⑤回收率試驗(yàn)。計(jì)算得平均回收率為98.00%,RSD為1.98%,表明該方法準(zhǔn)確可靠,可用于側(cè)柏葉中總黃酮的含量測(cè)定。2.1.3測(cè)量值由表1可知,3批樣品的總黃酮的平均含量為65.67%。2.2方法的回收率和精密度試驗(yàn)2.2.1方法學(xué)考察。①專屬性考察。圖1～3表明,在此條件下,穗花杉雙黃酮峰分離良好,陰性對(duì)照液在相應(yīng)位置無干擾。②線性關(guān)系的考察。計(jì)算得回歸方程為:Y=4000000X-16844,R=0.9997。試驗(yàn)結(jié)果表明,在0.13～1.3μg/ml范圍內(nèi),穗花杉雙黃酮濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。③重復(fù)性考察。計(jì)算得RSD為1.37%,表明方法重現(xiàn)性良好。④精密度的考察。計(jì)算得RSD為0.44%,表明在48h內(nèi),供試品溶液穩(wěn)定性良好。⑤回收率試驗(yàn)。計(jì)算得平均回收率為99.266%,RSD為1.48%,表明該方法準(zhǔn)確可靠,可用于側(cè)柏葉中穗花杉雙黃酮的含量測(cè)定。2.2.3含量測(cè)定。由表1可知,3批樣品的穗花杉雙黃酮150.967mg/g。3側(cè)柏葉黃酮含量測(cè)定中有效點(diǎn)的確定目前側(cè)柏葉黃酮被應(yīng)用于藥品、保健品以及日化