廣西豬群中siv與prrsv、csfv、prv、hps混合感染的調(diào)查

廣西豬群中siv與prrsv、csfv、prv、hps混合感染的調(diào)查

豬感染（sw）是由豬流感病毒（sw）引起的急性呼吸道疾病，傳播迅速，通常導致急性呼吸道疾病的暴發(fā)。該病一年四季都可發(fā)生,但以春秋多發(fā),各種日齡的豬都可感染。臨床上主要表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、呼吸困難、高燒,懷孕母豬有流產(chǎn)的可能。單純的SIV感染表現(xiàn)為發(fā)病率高,死亡率低,然而SIV與豬繁殖與呼吸綜合征(PRRSV)、2型豬圓環(huán)病毒(PCV-2)等引起免疫抑制的病毒混合感染時,會顯著增加上述疾病的損害程度和病死率。此外,SIV還是引起“豬高熱綜合征”的主要病原之一。SIV與其他病原體共感染或繼發(fā)感染所造成的損害,已成為制約豬場經(jīng)濟效益的主要原因之一。本研究應(yīng)用套式PCR方法對采自廣西境內(nèi)13個市122個不同規(guī)模豬場及農(nóng)村散養(yǎng)戶126份病料進行SIV檢測,并對15份鑒定為SIV陽性的病料再分別進行PRRSV、豬瘟病毒(CSFV)、PCV-2、豬偽狂犬病病毒(PRV)、副豬嗜血桿菌(HPS)的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣西發(fā)病豬群中SIV與PRRSV、CSFV、PCV-2的混合感染普遍存在。SIV與其它病原混合感染的調(diào)查結(jié)果為更好地研究“豬高熱綜合征”的相關(guān)病原提供了科學依據(jù)。1材料和方法1.1農(nóng)村散養(yǎng)戶病料收集廣西境內(nèi)13個市122個不同規(guī)模豬場及農(nóng)村散養(yǎng)戶126份病料,包括病豬肺、淋巴結(jié)、脾、腎、腦、胸水等組織,收集時間為2007年1月～7月(2005、2006年各有1份)。1.2抑制劑、taqna聚合酶、dntps、kAMV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司;RNA酶抑制劑、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量標準、蛋白酶K等購自TakaRa公司;Trizol購自Gibco公司。1.3引物的設(shè)計合成根據(jù)GenBank登錄的SIVNP、PRRSVORF7、CSFVE2基因、PCV-2全基因、PRVgD及HPS16SrRNA基因的核苷酸序列,設(shè)計合成以下分別用于這6種病原檢測的引物(表1)。1.4取精華組織材料1.4.1tri囊l的制備取約1g病豬組織(肺、淋巴結(jié)、脾、腎、腦等)于研磨器充分研磨,用Hank’s液1∶5稀釋,反復(fù)凍融3次,12000r/min離心1min;取上清液300μl,加入500μl的Trizol,混合均勻,室溫放置10min,加入160μl氯仿,混勻,室溫下放置2～3min,12000r/min4℃離心10min;取上清400μl轉(zhuǎn)移到新的EP管,再加入等量的異丙醇,混勻,室溫下放置10min,12000r/min4℃離心10min,棄上清,沉淀用75%乙醇洗滌,在超凈臺中通風晾干,RNA沉淀溶解于35μl用DEPC處理過的滅菌超純水中,置-20℃凍存?zhèn)溆谩?.4.2樣品處理和u3000制備用Hank’s按1∶3比例研磨病料,反復(fù)凍融3次后,8000r/min離心5min,取500μl上清,加入50μl10%SDS,20μl蛋白酶K(20mg/ml),55℃水浴消化1h,每15min搖1次;加等體積苯酚,12000r/min離心5min;取上清,加入等體積苯酚、氯仿(按1∶1比例),搖勻,12000r/min離心5min;取上清,加等量氯仿,混勻后12000r/min離心5min;取上清,加入1000μl預(yù)冷無水乙醇,再加入1/10體積3mol/L的NaAC;置-20℃沉淀30min,12000r/min離心15min,傾棄上清,用75%乙醇500μl洗滌2次;37℃烘干,加20μl雙蒸水溶解,置-20℃保存?zhèn)溆谩?.5核電站檢測1.5.1pcr擴增條件SIV檢測采用套式PCR方法,參照祁賢等(2005)的方法修改進行。第一輪PCR擴增反應(yīng)體系為25μl,反應(yīng)成分如下:上下游引物P1/P2各0.5μl、10mmol/LdNTP0.5μl、10×Buffer2.5μl、DNA模板2μl、Taq酶0.3μl(5U/μl),用滅菌雙蒸水加至總體積25μl。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,64℃退火30s,72℃延伸1min,30個循環(huán);然后72℃延伸10min。第二輪PCR擴增反應(yīng)成分為:上下游引物P3/P4各0.5μl、10mmol/LdNTP0.5μl、10×Buffer2.5μl、以1μl第一輪PCR擴增產(chǎn)物作為模板、Taq酶0.3μl(5U/μl),用滅菌雙蒸水補至總體積25μl。按95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,進行30個循環(huán);然后72℃延伸10min。瓊脂糖電泳鑒定,以出現(xiàn)287bp特異條帶的樣品為陽性。1.5.2常規(guī)pcr方法PRRSV、CSFV、PCV-2、PRV、HPS的檢測,按常規(guī)PCR的方法進行,具體參照婁高明等(2000)、蘆銀華等(2003)、Grego等(1989)、李學伍等(1996)、Oliveira等(2001)進行。2結(jié)果2.1pcr擴增結(jié)果運用套式PCR方法,對126份臨床組織病料進行檢測,結(jié)果有15份樣品擴增出大約287bp的特異條帶(第二輪PCR擴增),與預(yù)期結(jié)果一致(部分電泳結(jié)果見圖1)。2.2pcv陽性樣品及分布地區(qū)檢測結(jié)果用常規(guī)PCR方法對15份SIV陽性樣品進行PRRSV、CSFV、PCV-2、PRV和HPS檢測,結(jié)果8份為PRRSV陽性樣品,3份為CSFV陽性樣品,8份為PCV-2陽性樣品,PRV和HPS沒有檢出陽性樣品(電泳圖略),這些樣品的檢測結(jié)果及分布地區(qū)均列于表2。2.3混合感染的情況將15份SIV陽性樣品同時檢測其它5種病原菌的檢測結(jié)果進行分類整理,結(jié)果見表3。從中可以發(fā)現(xiàn)臨床上單純的SIV感染僅占26.7%(4/15),其余為混合感染,占73.7%(11/15)。在混合感染中三重感染(SIV+PRRSV+PCV-2、SIV+PRRSV+CSFV)高達40%(6/15),二重感染(SIV+PRRSV,SIV+PCV-2)占26.67%(4/15),最嚴重的多達到四重感染(SIV+PRRSV+CSFV+PCV-2)。其中又以SIV與PRRSV、PCV-2這2種病毒的混合感染最為嚴重,均達到53.33%(8/15),CSFV占20%(3/15)。表明豬群中病毒的混合感染十分嚴重。3siv與prrsv的混合感染本研究檢測的病料分別來自廣西13個市,幾乎遍布廣西,因此檢測結(jié)果具有一定的代表性,基本能夠反映廣西豬群中SIV的流行現(xiàn)狀。從檢測的結(jié)果看,廣西豬群中SIV的混合感染十分嚴重,其中又以與PRRSV、PCV-2這2種能夠引起免疫抑制的病毒的混合感染最為嚴重。臨床上主要表現(xiàn)為體溫升高、喘氣、咳嗽,斷奶前仔豬流鼻涕、精神沉郁、消瘦,部分豬耳朵發(fā)紺,有些豬拉黃色漿狀糞便,有些豬便秘。剖檢主要病理變化為鼻腔和氣管內(nèi)有泡沫狀黏液,肺有間質(zhì)性水腫、出血,全身淋巴結(jié)腫大,脾臟邊緣梗死,腎臟表面有出血點。因為SIV與其它病原混合感染嚴重,所以臨床癥狀,尤其是病理變化均表現(xiàn)得十分復(fù)雜,很少僅見到單純的SIV病變。由于病料收集時間為2007年1月～7月,此時正值廣西“豬高熱綜合征”流行高峰期,我們檢測發(fā)現(xiàn)SIV常與“豬高熱綜合征”的主要病原—PRRSV變異株(Nsp21594～1680變異株)混合感染,成為引起“豬高熱綜合征”的病原之一。SIV的存在加重了PRRSV變異株對豬體的損害程度和致死率,這一點從臨床上檢測有SIV混合感染發(fā)病豬的病變及死亡情況就可說明(另文報道)。目前,廣西豬群中SIV與其它病毒的混合感染十分嚴重,在所檢測的SIV陽性病料中三重感染(SIV+PRRSV+PCV-2、SIV+PRRSV+CSFV)高達40%,二重感染(SIV+PRRSV,SIV+PCV-2)占26.67%,最嚴重的多達到四重感染(SIV+PRRSV+CSFV+PCV-2)。應(yīng)引起高度重視,免疫抑制性病毒的普遍存在,會嚴重影響疫苗的免疫效果,我們在發(fā)生“豬高熱綜合征”的豬群中調(diào)查CSFV免疫抗體產(chǎn)生情況,發(fā)現(xiàn)普遍不達標,這也是造成CSFV發(fā)病