被動(dòng)運(yùn)動(dòng)和香丹注射液對失神經(jīng)大鼠腓腸肌和脛骨顯微結(jié)構(gòu)的影響

被動(dòng)運(yùn)動(dòng)和香丹注射液對失神經(jīng)大鼠腓腸肌和脛骨顯微結(jié)構(gòu)的影響

周圍神經(jīng)損傷容易導(dǎo)致消耗性骨松弛和消耗性肌肉痙攣。如何預(yù)防和控制非均質(zhì)性骨質(zhì)疏松癥和肌肉痙攣，在臨床觀察下，不同的預(yù)防和治療方法的療效仍然有限。本研究通過切斷大鼠的一側(cè)坐骨神經(jīng)和股神經(jīng)建立廢用性骨質(zhì)疏松模型,觀察被動(dòng)運(yùn)動(dòng)和香丹注射液對大鼠的腓腸肌、脛骨顯微結(jié)構(gòu)的影響,以期為廢用性骨質(zhì)疏松肌萎縮病人的早期預(yù)防、康復(fù)治療提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1動(dòng)物飼養(yǎng)分組3月齡雄性Wistar大鼠48只,體重(240.12±20.32)g(山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組、香丹組和聯(lián)合組,每組12只。大鼠單籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食、飲水,以國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。環(huán)境溫度18℃～24℃,相對濕度45%～55%,每天光照時(shí)間12h,大鼠飼養(yǎng)籠具、飲水瓶定期消毒,使用墊料均經(jīng)高壓滅菌。1.2術(shù)后被動(dòng)運(yùn)動(dòng)模型組、被動(dòng)運(yùn)動(dòng)、丹參組和聯(lián)合組大鼠3%戊巴比妥鈉(25mg/kg)腹腔麻醉,先將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺,在左后肢股骨近段和尾部近段剃毛,以碘伏消毒、鋪巾,觸摸到股骨大轉(zhuǎn)子后,在股骨大轉(zhuǎn)子與靠近尾部之間與后外方45°方向行長約1cm切口,逐層分離,在半腱肌、半膜肌和股二頭肌之間找到坐骨神經(jīng),靠近上段予以切除5mm,并將神經(jīng)斷端打結(jié)處理以預(yù)防斷端包塊的形成,用硫酸慶大霉素沖洗切口,然后縫合切口;再置大鼠于仰臥位,腹股溝處正中縱向切口,水平切斷大鼠左側(cè)股神經(jīng),游離遠(yuǎn)端5mm,同樣將神經(jīng)斷端進(jìn)行打結(jié)處理,慶大霉素沖洗并縫合切口。手術(shù)后給予肌注慶大霉素0.1ml,以預(yù)防感染,每天用酒精棉球和碘酒擦拭傷口,直至傷口愈合(大約5天左右)。假手術(shù)組只分離坐骨神經(jīng)和股神經(jīng),然后縫合切口。手術(shù)后假手術(shù)組、模型組進(jìn)行籠養(yǎng),不給予任何干預(yù)措施。被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組給予30天的被動(dòng)運(yùn)動(dòng),香丹組給予30天的香丹注射液灌胃,聯(lián)合組給予30天的被動(dòng)運(yùn)動(dòng)和香丹注射液灌胃。被動(dòng)運(yùn)動(dòng)方法:于手術(shù)后第3天,觀察傷口基本愈合,對被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行被動(dòng)運(yùn)動(dòng),首先進(jìn)行2天預(yù)運(yùn)動(dòng),大約3天左右動(dòng)物已經(jīng)基本適應(yīng)被動(dòng)運(yùn)動(dòng)且傷口已經(jīng)痊愈。被動(dòng)運(yùn)動(dòng)操作時(shí)雙手戴上加厚手套,一手固定大鼠于俯臥位,另一手抓住左后肢(手術(shù)側(cè))趾部,與脊柱呈45°向后外方向牽拉,直至左后肢完全伸直(膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)均伸直),然后再向與牽拉方向相反的方向,將左后肢推向身體使之完全屈曲緊貼身體(膝關(guān)節(jié)完全屈曲,踝關(guān)節(jié)完全背屈),如此一個(gè)往復(fù)為一個(gè)周期。2次/天,5分鐘/次,每側(cè)后肢每天共活動(dòng)600個(gè)周期。整個(gè)過程中動(dòng)作輕柔,速度適中,全關(guān)節(jié)幅度活動(dòng),初期以傷口不滲血為度。香丹注射液灌胃方法:于手術(shù)后第3天,給予香丹組大鼠香丹注射液(四川三精升和制藥有限公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z51021309)灌胃,按15g·Kg-1·d-1予以灌胃,持續(xù)30天。1.3固定和研磨法實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30天后,大鼠行頸靜脈取血、處死后,分離各組大鼠左側(cè)的腓腸肌,稱重,投入福爾馬林溶液固定24小時(shí)。分離左側(cè)脛骨,剔除軟組織,生理鹽水沖洗干凈,稱重后投入福爾馬林溶液固定24小時(shí)后,硝酸脫鈣。然后進(jìn)行常規(guī)脫水,透明,浸蠟,包埋。取腓腸肌最大橫斷面和脛骨的干骺端、中部的橫切面,切片機(jī)以厚度5um進(jìn)行連續(xù)切片,裱片后常規(guī)烤片,脫蠟至水,制成石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察分析比較各組大鼠腓腸肌和脛骨結(jié)構(gòu)的差異。1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel處理,數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,組間差異用T檢驗(yàn),P<0.05代表顯著性差異,P<0.01代表極顯著性差異。2結(jié)果2.1試驗(yàn)組患者重、脛骨重量的變化與假手術(shù)組相比,模型組的損傷側(cè)肌濕重/對側(cè)肌濕重極顯著降低,脛骨重量顯著降低。與模型組相比,被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組、香丹組、聯(lián)合組的損傷側(cè)肌濕重/對側(cè)肌濕重顯著性升高,聯(lián)合組的脛骨重量顯著性增加。2.2材料肌纖維生長情況肉眼觀察假手術(shù)組大鼠的腓腸肌較飽滿,有彈性,外觀有光澤,模型組大鼠腓腸肌萎縮明顯,外觀較黯淡、部分有粘連現(xiàn)象。模型組大鼠出現(xiàn)皮膚潰瘍、水腫例數(shù)比被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組、香丹組多,且恢復(fù)時(shí)間長。假手術(shù)組腓腸肌顯微結(jié)構(gòu)顯示肌纖維排列緊密,肌細(xì)胞豐滿,肌膜清晰(圖1);模型組顯示肌纖維萎縮,其直徑和橫截面變小,部分肌纖維輪廓模糊(圖2);被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組顯示與模型組相比肌纖維直徑和橫截面增加,肌纖維輪廓相對清晰(圖3);香丹組顯示與模型組相比肌纖維豐滿,直徑和橫截面積增加明顯(圖4);聯(lián)合組顯示肌纖維排列緊密,直徑和橫截面積顯著增加,肌纖維輪廓清晰(圖5)。2.3骨小梁數(shù)目的影響本研究重點(diǎn)對脛骨遠(yuǎn)端橫切面進(jìn)行觀察,脛骨遠(yuǎn)端主要由松質(zhì)骨構(gòu)成。假手術(shù)組的顯微結(jié)構(gòu)顯示骨小梁粗壯、飽滿,形態(tài)結(jié)構(gòu)完整(圖6);模型組顯示與假手術(shù)組相比骨小梁數(shù)目明顯變少,纖細(xì),排列稀疏,形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性差(圖7);被動(dòng)運(yùn)動(dòng)組顯示與模型組相比部分區(qū)域骨小梁數(shù)目增加,排列相對緊密(圖8);香丹組顯示與模型組相比骨小梁排列相對緊密,且可觀察到軟骨細(xì)胞、軟骨組織的增加(圖9);聯(lián)合組顯示骨小梁相對粗壯,數(shù)目明顯增加,排列相對緊密(圖10)。3被動(dòng)運(yùn)動(dòng)治療失神經(jīng)疾病的臨床應(yīng)用失神經(jīng)支配后其相應(yīng)的骨骼肌收縮功能喪失,由于肢體的制動(dòng)引起關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍減少,對骨骼肌以及骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能將產(chǎn)生不利的影響。本研究結(jié)果顯示,失神經(jīng)大鼠經(jīng)30天自然恢復(fù),腓腸肌損傷側(cè)肌濕重/對側(cè)肌濕重、脛骨重量顯著下降,其肌纖維萎縮,骨小梁變少排列稀疏。Wakley等報(bào)道,失神經(jīng)大鼠脛骨皮質(zhì)部分的皮質(zhì)面積降低11.3%,橫切面降低8.4%,骨外膜形成率減少32.6%。徐建廣等報(bào)道,失神經(jīng)大鼠腓腸肌肌細(xì)胞直徑和橫截面積下降,線粒體、肌質(zhì)網(wǎng)退變,以上結(jié)果表明失神經(jīng)影響了骨骼肌、骨的結(jié)構(gòu)變化,進(jìn)而影響了功能的發(fā)揮,最終導(dǎo)致廢用性肌萎縮和廢用性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。被動(dòng)運(yùn)動(dòng)操作簡單、方便、安全,目前廣泛應(yīng)用于治療各種失神經(jīng)疾病中,徐建廣等報(bào)道,被動(dòng)運(yùn)動(dòng)延緩了失神經(jīng)大鼠損傷側(cè)肌細(xì)胞直徑和橫截面積的下降。陳德松等觀察被動(dòng)運(yùn)動(dòng)提高了損傷側(cè)腓腸肌的重量和直徑。潘孝貴等研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,失神經(jīng)大鼠骨小梁體積密度、骨小梁平均寬度、骨小梁連接點(diǎn)數(shù)顯著減少,游離末端數(shù)顯著增加。本研究結(jié)果顯示,30天的被動(dòng)運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了腓腸肌、脛骨纖維結(jié)構(gòu)的變化,提示失神經(jīng)導(dǎo)致骨小梁、腓腸肌的顯微結(jié)構(gòu)破壞,而被動(dòng)運(yùn)動(dòng)可逆轉(zhuǎn)這種趨勢。分析原因,可能與被動(dòng)運(yùn)動(dòng)使不能主動(dòng)收縮的肌纖維活動(dòng),一方面促進(jìn)了骨骼肌、脛骨的血液循環(huán),代謝產(chǎn)物的清除,另一方面通過機(jī)械牽拉作用使骨組織產(chǎn)生和保持一定的力學(xué)刺激,從而改善了失神經(jīng)大鼠的腓腸肌、脛骨的顯微結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn),被動(dòng)運(yùn)動(dòng)能夠誘導(dǎo)開啟或關(guān)閉不同基因表達(dá),改變不同亞基表達(dá)水平,如Ca2+-ATP酶、二氫喋啶還原酶的活性,肌球蛋白重鏈同分異構(gòu)體的轉(zhuǎn)變,使骨骼肌、骨更能適應(yīng)環(huán)境的變化,其具體作用過程可能多種因子、蛋白參與其中,各種基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞信號通路等調(diào)控機(jī)制正在逐步闡明。香丹注射液服用方便、經(jīng)濟(jì),其成分為丹參、降香,丹參活血化瘀,降香理氣開竅,二者合用有協(xié)同作用。藥理研究丹參有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈流量的作用,常用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等疾病,且能改善血瘀患者的血液流變學(xué)。目前尚無關(guān)于香丹注射液對失神經(jīng)導(dǎo)致的廢用性肌萎縮和廢用性骨質(zhì)疏松的文獻(xiàn)報(bào)道,本研究結(jié)果顯示,香丹注射液具有提高濕肌重、脛骨重量的作用,而且改善了腓腸肌、脛骨的顯微結(jié)構(gòu),其結(jié)果為擴(kuò)大香丹注射液的臨床適應(yīng)癥范圍以及將其用于廢用性肌萎