第七章-培養(yǎng)細(xì)胞中克隆基因的表達(dá)

第七章：培養(yǎng)細(xì)胞中克隆基因的表達(dá)及動(dòng)物基因工程本章概述基因調(diào)控的研究（有關(guān)原核和真核生物的表達(dá)載體、報(bào)告基因等）基因在細(xì)胞系中表達(dá)的方法篩選陽性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞的遺傳標(biāo)記哺乳動(dòng)物中瞬時(shí)轉(zhuǎn)化載體（以SV40為例）基因定點(diǎn)敲除技術(shù)第一節(jié)基因調(diào)控的研究一、表達(dá)載體一類在多克隆位點(diǎn)的5‘端含有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的克隆載體。由于真核生物和原核生物啟動(dòng)子的不同，需要針對(duì)不同的宿主設(shè)計(jì)不同的載體。A、在大腸桿菌中的外源基因表達(dá)載體(1)典型的原核基因以及其RNA的特點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止序列

GC-richinvertedrepeat5’-GTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACT

CAGTTTTCGGAGGCCAGCCTCCGAAAACTGA-5’RunofAresidues依賴ρ因子的終止子不依賴ρ因子的終止子真核基因的啟動(dòng)子不能被原核RNA聚合酶識(shí)別真核基因在原核生物中表達(dá)，必須把基因序列置于原核基因的框架內(nèi).(2)真核基因和原核基因的區(qū)別(3)啟動(dòng)子是表達(dá)載體的關(guān)鍵部分——選擇啟動(dòng)子

······TTGACA

·····························TATAAT

····GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATATTGTCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTACGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGACACTTGATACTGTATGAAGCATACAGTATAATTGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTTAATGT

-35Region-10GegionConsensuslactrpλPLrecAtacItacII-10和-35堿基序列和通序啟動(dòng)子的強(qiáng)弱與它們與共有序列的相似程度有關(guān)。相似性越高，就越強(qiáng)；反之。。。。。序列盒和基因融合在載體上將啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止信號(hào)按較合理的置于載體上，這樣的序列叫做序列盒外源基因插入在序列盒中間，通常與細(xì)菌的一段基因形成融合基因，所以在構(gòu)建這類載體時(shí)，一定需要閱讀框的正確。融合載體的四大優(yōu)點(diǎn)：利用大腸桿菌天然序列，可以保證有效地翻譯起始防止外源蛋白被降解可以被輸出到胞外，利于純化可以便于親和層析(4)大腸桿菌中高效表達(dá)基因的策略優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計(jì)提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)作用提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性優(yōu)化發(fā)酵過程B、在真核細(xì)胞中外源基因表達(dá)載體真核生物的啟動(dòng)子序列包含：1）核心元件（TATA盒，起始子等）2）上游元件(CAAT盒等）3）遠(yuǎn)上游調(diào)控(增強(qiáng)子等）B、真核生物的表達(dá)載體通常含有真核基因的啟動(dòng)子序列表達(dá)載體的啟動(dòng)子區(qū)基本表達(dá)組成型表達(dá)細(xì)胞特異表達(dá)調(diào)節(jié)型表達(dá)MCSTATASP1AP1CAAT細(xì)胞特異調(diào)節(jié)型表達(dá)二、報(bào)告基因報(bào)告基因應(yīng)滿足的條件1）編碼特異的蛋白酶活性，宿主細(xì)胞中沒有2）酶活檢測(cè)應(yīng)快速、簡(jiǎn)便、靈敏等3）報(bào)告蛋白不影響宿主細(xì)胞的正?；钚猿Ｓ玫腉FP(YFP)、lacZ、GUS等第二節(jié)基因在細(xì)胞中的表達(dá)方法一、基因轉(zhuǎn)染的策略

一般基因轉(zhuǎn)化的的策略直接轉(zhuǎn)化:用物理的方法直接將外源DNA轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞中去。

轉(zhuǎn)染:用一系列物理和化學(xué)的方法迫使細(xì)胞能從周圍的介質(zhì)中接受DNA。?轉(zhuǎn)導(dǎo):動(dòng)物病毒animalvirus一、基因轉(zhuǎn)染的策略1.DNA/磷酸鈣共沉淀的方法轉(zhuǎn)化過程A、將待轉(zhuǎn)染的DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液B、逐滴加入到Hepes-磷酸鹽緩沖液中，形成磷酸鈣-DNA共沉淀C、用吸管將共沉淀物加到培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物單層細(xì)胞表面，會(huì)迅速被細(xì)胞捕獲，頻率約10％（二）脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體(liposomes)是一種人造的脂質(zhì)小泡，外周是脂雙層，內(nèi)部是水腔一、基因轉(zhuǎn)染的策略一、基因轉(zhuǎn)染的策略（三）電穿孔法在高壓電脈沖的作用下使細(xì)胞膜上出現(xiàn)微小的孔洞，從而促使不同細(xì)胞之間發(fā)生原生質(zhì)體融合或促使細(xì)胞吸收外界環(huán)境中的DNA分子一、基因轉(zhuǎn)染的策略（四）、直接轉(zhuǎn)化－微注射真正的顯微注射穿刺一、基因轉(zhuǎn)染的策略二、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)化）外源DNA不與宿主的基因組DNA整合，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。常用于較短時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，如啟動(dòng)子功能檢測(cè)，蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位等三、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化外源基因整合到細(xì)胞染色體中，隨著細(xì)胞的分裂而傳代（或子代的形成），產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系（或個(gè)體）。通常用于研究基因的功能或改變生物個(gè)體的性狀。第三節(jié)：篩選陽性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞的遺傳標(biāo)記內(nèi)源的選擇標(biāo)記這些基因存在于野生型的細(xì)胞中只能在相關(guān)基因發(fā)生了突變（失去功能）的突變體細(xì)胞中應(yīng)用顯性的選擇標(biāo)記賦予細(xì)胞一個(gè)完全新的表型，可以在多個(gè)細(xì)胞系中進(jìn)行利用。哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記

遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機(jī)理APH-氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶G418APH滅活G418DHFR二氫葉酸還原酶氨甲喋呤DHFR突變體抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶 潮霉素BHPH滅活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脫氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA滅活Xyl-A1.胸苷激酶基因選擇系統(tǒng)TK－細(xì)胞

把細(xì)胞培養(yǎng)在加有胸苷類似物5-溴尿嘧啶脫氧核苷（BUdR）的培養(yǎng)基中，在胸苷激酶（TK）的催化下，BUdR便摻入到細(xì)胞的DNA分子上，致使DNA復(fù)制出現(xiàn)錯(cuò)誤。具有BUdR-DNA的細(xì)胞對(duì)UV特別敏感，被迅速地殺死，而少數(shù)TK－的細(xì)胞便能存活下來HAT選擇法：在含有次黃嘌呤(Hypoxanthine)、氨基蝶呤(Aminopterin抑制了正常的核苷酸合成)和胸苷(Thymidine)的培養(yǎng)基中篩選TK+細(xì)胞共轉(zhuǎn)化選擇。在磷酸鈣沉淀中，有兩種形體上沒有連接的DNA組成的混合物，能夠同時(shí)轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞將無選擇標(biāo)記的DNA與具TK選擇標(biāo)記基因的DNA進(jìn)行混合轉(zhuǎn)化外源DNA可整合到核基因組的任何部位把TK基因先與非選擇標(biāo)記基因連接起來，也能共轉(zhuǎn)化1.胸苷激酶基因選擇系統(tǒng)90%的TK+細(xì)