工業(yè)用微生物菌種課用

發(fā)酵工程FermentationEngineering第二章發(fā)酵工業(yè)菌種本章內(nèi)容

一、常用的工業(yè)微生物二、發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的原則與基本技術(shù)三、發(fā)酵工業(yè)菌種改良最常用的工業(yè)微生物細(xì)菌醋酸桿菌屬制醋工業(yè)的菌種乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌假單胞菌熒光假單胞菌熒光假單胞菌(P.fluorescens)屬于假單胞菌屬rRNAI群熒光DNA同源組，是植物根際最普遍的微生物類群，具有分布廣、數(shù)量多、營養(yǎng)需要簡單、繁殖快、競爭定殖力強(qiáng)的特點(diǎn)。熒光假單胞菌，而且許多菌株能產(chǎn)生幾種活性物質(zhì)，抗多種植物病害。其作用機(jī)制包括：抗生素的作用、噬鐵素對鐵的營養(yǎng)競爭、有效的根際定殖等。世界許多國家均有人報(bào)道分離到抗植物病害的熒光假單胞菌,而且許多菌株能產(chǎn)生幾種活性物質(zhì),如抗油菜菌核病的菌株。銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）谷氨酸發(fā)酵菌種日前用于谷氨酸發(fā)酵的菌種有谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、黃色短桿菌、嗜氨小桿菌、球形節(jié)桿菌。我國常使用的生產(chǎn)菌株是北京棒桿菌AS1.299、北京棒桿菌D110、鈍齒棒桿菌A51.542、棒桿菌S-914和黃色短桿菌T6~T13等。在己報(bào)道的谷氨酸生產(chǎn)菌中，除芽孢桿菌外，雖然它們在分類學(xué)上屬于不同的屬種，但都有一些共同的特點(diǎn)，如菌體為球形、短稈至棒狀、無鞭毛、不運(yùn)動、不形成芽孢、呈革蘭氏陽性、需要生物素做生長因子、在通氣條件下培養(yǎng)產(chǎn)生谷氨酸。谷氨酸發(fā)酵機(jī)制谷氨酸的生物合成途徑大致是：葡萄糖經(jīng)EMP途徑或HMP途經(jīng)生成丙酮酸→再氧化成乙酰輔酶A→然后進(jìn)入TCA→再通過乙醛酸循環(huán)、CO2固定作用→生成a-酮戊二酸→谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4+存在的條件下生成谷氨酸谷氨酸生產(chǎn)菌能夠在體外積累菌體最大生長需要量300多倍的谷氨酸，研究發(fā)現(xiàn)：大量積累并非是當(dāng)初設(shè)想的由于特異代謝途徑導(dǎo)致，而是：代謝調(diào)節(jié)控制；細(xì)胞膜通透性的特異調(diào)節(jié)；發(fā)酵條件的適合。谷氨酸菌種的定向選育改變細(xì)胞膜的通透性：生物素（乙酰CoA羧化酶的輔酶）營養(yǎng)缺陷型株喪失脂肪酸合成酶的油酸缺陷型；喪失a-磷酸甘油酶的甘油缺陷型。選育溫度敏感突變株：例：使用典型的溫度敏感突變株TS-88生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，通過控制發(fā)酵條件，在生長適當(dāng)階段將發(fā)酵溫度由30℃提高到40

℃，可在生物素含量為33ug/L，含糖3.6%的甜菜糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基中，產(chǎn)生20g/L谷氨酸，對糖轉(zhuǎn)化率>55%。生物素對谷氨酸發(fā)酵的影響生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶——乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與了脂肪酸的生物合成，進(jìn)而影響磷脂的合成。當(dāng)控制生物素在亞適量時(shí)，脂肪酸合成就不完全，導(dǎo)致磷脂合成不完全。而細(xì)胞膜是由磷脂雙分子層組成的，當(dāng)磷脂含量減少到正常時(shí)的一半左右時(shí)，細(xì)胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲出、積累于發(fā)酵液中。如果生物素過量，則發(fā)酵過程菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，代謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多。生物素亞適量的原因（2ug/L~5ug/L）

：當(dāng)生物素缺乏時(shí)，菌種生長十分緩慢；當(dāng)生物素過量時(shí)，則轉(zhuǎn)為乳酸發(fā)酵。在谷氨酸發(fā)酵過程中，影響菌種代謝途徑的因素見下表。第36頁，共69頁防止噬菌體和雜菌的污染谷氨酸生產(chǎn)菌一

般都是生物素缺陷型，而在發(fā)酵培養(yǎng)基中又大多是控制生物素亞適量，所以谷氨酸生產(chǎn)菌對噬菌體和雜菌的抵抗能力較弱。最怕污染噬菌體，輕則出現(xiàn)谷氨酸收率低、難提取，重則倒罐，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。所以，雜菌和噬菌體的防治工作就顯得特別重要。一定要從空氣過濾、培養(yǎng)基、設(shè)備、環(huán)境等環(huán)節(jié)嚴(yán)格把關(guān)。最常用的工業(yè)微生物酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬：酒精發(fā)酵工業(yè)及釀造工業(yè)的有害菌1、酵母菌形態(tài)：酵母菌是一群單細(xì)胞的真核微生物,其形態(tài)因種而異.通常為圓形、卵圓形或橢圓形。也有特殊形態(tài)，如檸檬形、三角形、藕節(jié)狀、臘腸形，假菌絲等。酵母菌假菌絲:酵母菌在一定條件下培養(yǎng)，產(chǎn)生的芽體與母細(xì)胞不分離形成的特殊形態(tài)。啤酒酵母的菌落紅酵母的菌落各種酵母菌的菌落酵母菌菌落最常用的工業(yè)微生物霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點(diǎn)青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉最常用的工業(yè)微生物放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動放線菌未培養(yǎng)微生物定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物，其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％。研究方法①模擬自然培養(yǎng)法:原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、單細(xì)胞操作②宏基因組分析法二、發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選原則與基本技術(shù)（一）發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢與要求（二）分離篩選原理與技術(shù)（三）應(yīng)用舉例

1.菌種選擇的總趨勢野生菌→變異菌自然選育→代謝控制育種誘發(fā)基因突變→基因重組的定向育種

純凈健壯產(chǎn)量質(zhì)量穩(wěn)定2易于控制培養(yǎng)條件,周期短3對誘變劑敏感4抗污染力強(qiáng)5原料廉價(jià),生長迅速,目的產(chǎn)物產(chǎn)量高6不是病原菌12、微生物工業(yè)對菌種的要求7產(chǎn)物分泌型工業(yè)菌種的改良方法解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個(gè)旁路代謝途徑。增加前體物的深度。改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高深度的有潛在毒物的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。抑制或消除產(chǎn)品分解酶。改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力。消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制，如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。工業(yè)菌種的改良方法（二）分離篩選原理與技術(shù)1.篩選的指導(dǎo)思想2.分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個(gè)方面3.

新種分離篩選原理與技術(shù)1.篩選的兩種指導(dǎo)思想

先分離純化，再結(jié)合工藝要求進(jìn)行篩選。分離純化同時(shí)富于篩選條件，一步得出所需菌株。結(jié)果有兩種可能：獲得適于工業(yè)發(fā)酵菌株只獲得選育所需的出發(fā)菌株

2.分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個(gè)方面從被污染的生產(chǎn)及科研用菌中分離目的菌；

生產(chǎn)中長期使用的菌種的定期分離篩選；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業(yè)目的的優(yōu)良菌株；從保藏機(jī)構(gòu)獲取菌種好處：經(jīng)濟(jì)性、指導(dǎo)性從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)生菌；尋找老產(chǎn)品的新的優(yōu)良菌株。國際承認(rèn)的中國培養(yǎng)物保藏單位武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC。保藏了幾乎所有的培養(yǎng)物。(CCTCC)國際承認(rèn)的中國培養(yǎng)物保藏單位中科院微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC。保藏有普通菌種。(CGMCC)此外，較著名的中國培養(yǎng)物保藏單位還有中國微生物菌種保藏管理委員會CCCCM——管理機(jī)構(gòu)3.新種分離與篩選的步驟

調(diào)查研究（包括資料查閱）

試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

含微生物樣品的采集

（如何使樣品中含所需微生物的可能性大？）

樣品預(yù)處理（如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實(shí)現(xiàn)）

菌種分離

根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點(diǎn)分

選擇性分離方法 隨機(jī)分離方法

(定向篩選←選擇壓力)

(用篩選方案-檢測系統(tǒng)進(jìn)行間接分離）

富集液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基條件培養(yǎng)

(初篩)

菌種純化

復(fù)篩

菌種純化初步工藝條件摸索再復(fù)篩生產(chǎn)性能測試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)試驗(yàn)?zāi)承┍匾囼?yàn)和或作為育種的出發(fā)菌株毒性試驗(yàn)等

（1）含微生物樣品的采集采樣時(shí)應(yīng)注意的問題:土壤微生物的分布采土深度：5~25cm土壤植被情況采樣季節(jié)土壤的酸堿度對于分離篩選新菌種，還存在另兩個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn)：土壤來源廣泛在已適應(yīng)相當(dāng)苛刻環(huán)境壓力的微生物類群中尋找新菌種采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主；富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。細(xì)菌（108）>放線菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻類（104）>原生動物（103）從自然界篩選2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時(shí)分離。（2）樣品的預(yù)處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理；膜過濾法；離心法化學(xué)方法：化學(xué)成分增加特定微生物的數(shù)量誘餌法：富集目的菌膜過濾法當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí),可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器,然后將將膜轉(zhuǎn)到相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),對形成的菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。例如：放線菌的分離篩選，培養(yǎng)基的組成原則大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落。在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。選擇性地添加抗生素。分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱中存放3天。放線菌的分離土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。水中放線菌的分離：為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過濾，取離心沉積或?yàn)V紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。次代培養(yǎng)及純化菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分。通過高倍放大進(jìn)行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時(shí)顯得尤為重要。將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng)，以進(jìn)一步篩選和分離。（3）分離方法的選擇

根據(jù)目的菌有無選擇性特征來選擇分離方法菌種的營養(yǎng)特征獨(dú)特

生長特征獨(dú)特

無選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進(jìn)行

隨機(jī)分離選擇性分離的關(guān)鍵：生長培養(yǎng)條件的選擇與控制，從而實(shí)現(xiàn)定向富集篩選。選擇性分離

A、選擇性分離原理和技術(shù)1、生長條件的選擇與控制原理控制營養(yǎng)成分

控制培養(yǎng)基酸堿度

添加抑制劑

控制培養(yǎng)溫度

控制通氣條件

2、選擇性分離技術(shù)富集液體培養(yǎng)技術(shù)固體培養(yǎng)技術(shù)施加選擇壓力，進(jìn)行定向篩選

①富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長或不利于目的菌以外的其他菌型生長的條件培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式：以最大比生長速率（μmax）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時(shí)間和次數(shù)等問題連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長速率（μ）篩選

μ

ABS0基質(zhì)濃度對A、B兩種菌的比生長速率（μ）的影響

當(dāng)S<S0時(shí)，富集什么菌株？當(dāng)S>S0時(shí)，富集什么菌株？連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長速率μ篩選連續(xù)富集培養(yǎng)技術(shù)分離菌株的優(yōu)點(diǎn)

分離的菌株特別適合連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過程有利于分離具有某種工業(yè)生產(chǎn)特性的菌株可以篩選出能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物

②固體培養(yǎng)技術(shù)常用于分離某些酶產(chǎn)生菌

選擇壓力：在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質(zhì)

隨機(jī)分離原理與技術(shù)從產(chǎn)物入手，通過設(shè)計(jì)高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的篩選方法，從隨機(jī)分離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術(shù)關(guān)鍵：產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應(yīng)篩選方法的確定。隨機(jī)分離技術(shù)舉例

抗生素產(chǎn)生菌的篩選藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選生長因子產(chǎn)生菌的篩選多糖產(chǎn)生菌的篩選

高產(chǎn)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的幾個(gè)原則

制備一系列的培養(yǎng)基，其中有各種類型的養(yǎng)分成為生長限制因素；使用一聚合或復(fù)合形式的生長限制養(yǎng)分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代謝物阻遏；確定含有所需的輔因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH緩沖劑以減少pH變化；前體、促進(jìn)劑及抑制劑的采用。抗生素產(chǎn)生菌的篩選篩選模型：試驗(yàn)菌篩選方法：鋪菌法復(fù)印平板法液體培養(yǎng)篩選

抗藥性篩選篩選模型：氨芐青霉素和β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌（克雷白氏菌）協(xié)同I II無試樣時(shí)（不含棒酸時(shí)），I對II菌作用不大有試樣時(shí)（含棒酸時(shí)），I對II菌恢復(fù)藥效，棒酸抑制水解酶活性

固體培養(yǎng)篩選試驗(yàn)菌代表微生物類型金黃色葡萄球菌209p革蘭氏陽性球菌枯草桿菌6633 革蘭氏陽性桿菌 大腸桿菌革蘭氏陰性腸道細(xì)菌恥垢分枝桿菌607 結(jié)核桿菌 白色念珠菌 酵母狀真菌 青霉菌

絲狀真菌

藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選

藥理活性化合物是指能抑制人類代謝中某一個(gè)關(guān)鍵酶的微生物產(chǎn)物即酶抑制劑，從而達(dá)到治療的目的。篩選模型：目標(biāo)酶生長因子產(chǎn)生菌的篩選

篩選模型：營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌

篩選方法：利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進(jìn)營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌生長氨基酸產(chǎn)生菌的篩選

樣品

預(yù)處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長獲得多個(gè)單菌落復(fù)印平板（copy法）

平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對應(yīng)到copy前相應(yīng)u.v線殺死長好的菌落

位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌的瓊脂

培養(yǎng)后

產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，對產(chǎn)物進(jìn)行定量測定篩選產(chǎn)物含量高的菌株多糖產(chǎn)生菌的篩選取樣特點(diǎn)：碳水化合物工業(yè)的廢棄物篩選方案：從菌落外觀判斷，選擇外觀呈粘液狀的菌落，然后根據(jù)液體培養(yǎng)測定多糖含量來篩選高產(chǎn)菌。4、幾種典型微生物的分離篩選方法舉例細(xì)菌放線菌真菌細(xì)菌分離：以乳酸菌為例

取未成熟的醬醪樣品1g至無菌磨口瓶中

加麥芽汁至瓶口處，封塞，25℃培養(yǎng)24-48h培養(yǎng)基中長出絹絲狀波動物，鏡檢桿狀，陽性染色初步斷定乳酸菌

用選擇性培養(yǎng)基分批富集培養(yǎng)2-3代稀釋分離法分離單菌落，培養(yǎng)基為含麥芽汁、CaCO3的瓊脂培養(yǎng)基

根據(jù)透明圈挑選菌落

性能測定（鏡檢桿狀，染色陽性；乳酸紙層析鑒定）

Rf值定性（有機(jī)酸呈黃斑點(diǎn)）

乳酸生成量測定（滴定法）放線菌的分離：

以產(chǎn)鏈霉素菌種的分離為例

（從退化菌種中篩選）

取工業(yè)發(fā)酵液（含孢子）樣品1環(huán)放入帶玻璃珠的裝有10ml無菌水的小三角瓶中，搖勻

采用稀釋法制平板，獲取單菌落

斜面保藏高產(chǎn)菌恢復(fù)根據(jù)高產(chǎn)菌的特點(diǎn)，選擇目的菌落放大培養(yǎng)，發(fā)酵液性能測試篩選模型：形態(tài)依據(jù)真菌的分離篩選：以啤酒酵母的分離為例

取發(fā)酵液少許以10倍稀釋成10-1-10-7

稀釋分離法取0.1ml加入固體培養(yǎng)基鋪平皿（×2）

在麥芽汁固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48-72h形態(tài)篩選根據(jù)正常株特點(diǎn)進(jìn)行挑選，接種斜面?zhèn)溆?/p>

純化，采用平板分離法進(jìn)一步純化，至少反復(fù)三次

①生成子囊孢子速度測定 ②發(fā)酵力測定性能測定③熱死溫度測定 ④凝集力測定 ⑤雙乙酰含量測定菌種選育改良的具體目標(biāo)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品第二節(jié)發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育常規(guī)育種(誘變育種)細(xì)胞工程育種基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù)基因工程育種蛋白質(zhì)工程育種代謝工程育種

選擇育種方法時(shí)綜合考慮的因素(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn))；(2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬面認(rèn)識的明了程度；(3)經(jīng)濟(jì)費(fèi)用。如果對特定菌