玉米蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢驗中常見的問題

玉米蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢驗中常見的問題

采用電泳法對樣品的種子和幼苗的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和染色，形成蛋白質(zhì)電泳帶的差異，并將其與標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行比較。以確定品種的真實性和純度。不同作物品種的基因不同,基因的直接表達(dá)產(chǎn)物———蛋白質(zhì)在種類、數(shù)量、結(jié)構(gòu)等方面也不同。該法即是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性來反映不同品種DNA組成上的差異,從而進(jìn)行品種鑒定。該法快速、可靠,不受環(huán)境影響。其基本操作程序一般包括七大步驟:樣品提取→凝膠制備→點樣→電泳→譜帶染色→譜帶鑒定→圖譜保存。下面就這七個步驟中常見的問題及原因做簡要分析:1樣品提取1.1采樣不具有代表性：隨機(jī)采集樣品，采集檢測霉、變質(zhì)、昆蟲和中毒種子，并進(jìn)行意外檢查1.2樣品損失或污染：樣品粉末過程中存在損失或粒間交叉污染1.3提取完成后提取液加入后沒有充分搖勻,提取期間至少搖勻兩次。樣品提取時間不宜太長,一般不超過4h。2凝膠制備2.1連接板：玻璃板沒有清潔、清潔，導(dǎo)致連接板2.2凝膠不均勻：插入粘合劑時，沒有完全搖勻，緩慢。應(yīng)立即從一端注入，避免泡沫和凝膠不均勻2.3橡膠表面不均勻：打開和分離橡膠時的操作非常簡單，樣品的清潔應(yīng)放置在頂部，拔高時應(yīng)小心維護(hù)橡膠表面，以免損壞橡膠表面3采樣點的質(zhì)量3.1采樣能力不允許：采樣量通常為15l，各槽的采樣量應(yīng)一致。如果譜帶太寬，你就不會知道，或者太少，可能會失去譜帶3.2樣品溶液污染：在采樣前，請不要清潔樣品裝置。如上所述，應(yīng)清潔每個點2.3次，以防止交叉污染4電泳4.1電泳槽無法通行：電板的反向連接。一般，陽離子電泳包括極接地槽阻力和負(fù)接手槽長板4.2綠色標(biāo)志材料未移動電壓設(shè)定不合適,應(yīng)調(diào)節(jié)電壓為500V;也可能室內(nèi)溫度不適宜,電泳溫度一般在15～20℃下進(jìn)行較好。5染色5.1粘合板：取膠時，粘附板非常嚴(yán)重，因為玻璃板沒有清潔，需要更換玻璃板5.2染色速度緩慢可能原因是染色溫度低,正常染色溫度可在室溫進(jìn)行,若希望染色速度加快可適當(dāng)提高溫度。6譜帶的確定分析蛋白質(zhì)電泳譜帶的異常情況:大多數(shù)雜交種電泳譜帶是一致的,但有些雜交種個別籽粒會出現(xiàn)一些異常情況。6.1種譜帶型某粒雜交種出現(xiàn)一條該雜交種所不具有的譜帶(這稱為新譜帶型),而其它譜帶和該雜交種完全一致。此情況可能是由于制種時某些籽粒發(fā)生突變或自交系中有突變體造成的(親本是二環(huán)系或混合體的雜交種易出現(xiàn)),應(yīng)按雜交種計算。6.2互補(bǔ)帶的出現(xiàn)雜交種中有多條互補(bǔ)帶出現(xiàn)時,其中某?？赡苡幸粭l譜帶不出現(xiàn)互補(bǔ)而呈偏親型譜帶出現(xiàn),其它互補(bǔ)帶仍然出現(xiàn)。我們認(rèn)為該籽粒為雜交種,只是雜交不完全或發(fā)生突變。7結(jié)果保存光譜帶保存7.1濕保存：保存時間短。將凝膠板浸泡在7%乙醇溶液中，并將其放入塑料袋中。這可以保存半年以上7.2玻璃紙沉法或稱溶膠質(zhì)法膠片不理想。制干膠片應(yīng)將玻璃板充分洗凈,在其上面平鋪一層已經(jīng)甘油水溶液(30%)浸透的玻璃紙,然后將膠片洗凈,放在玻璃紙上,再蓋上一層已經(jīng)甘油水溶液浸透的玻璃紙,四周壓實,貼上標(biāo)簽,自然干躁或放烘箱中(<40℃)緩慢烘干。以上即是蛋白質(zhì)電泳法玉米純度檢驗中常見的問題及原因。雖然從理論上講,任何玉米品種間的蛋白質(zhì)組成均存在著差異,但是任何技術(shù)均會有局限性,何況