香蕉皮中單寧的提取及抑菌活性研究

香蕉皮中單寧的提取及抑菌活性研究

香蕉是香蕉科的一種典型的熱帶作物，具有豐富的營養(yǎng)。然而，作為一種極其豐富的垃圾資源，香香蕉皮尚未得到有效開發(fā)和利用。單寧又稱鞣質(zhì),廣泛存在于植物體的葉、殼、果肉以及樹皮中。不同原料中的單寧,在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有很大的差異,性質(zhì)也不完全相同;但他們都是多元酚類的衍生物,單寧所具有的多種生理活性,如止血、抑菌、抗過敏、抗突變、抗癌、抗衰老、抗腫瘤等,正是這些基本化學(xué)性質(zhì)的綜合體現(xiàn)。有關(guān)于香蕉皮中單寧的提取及抑菌方面的研究尚不多見。本研究利用正交試驗方法對香蕉皮中單寧的最佳提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,并對其抗菌特性進(jìn)行了初探,與常用食品防腐劑山梨酸鉀的抑菌效果進(jìn)行對比,以探討香蕉皮單寧作為食品天然防腐劑的應(yīng)用前景,并為單寧作為天然抑菌劑提供理論依據(jù),同時為香蕉皮的綜合利用開辟一條新途徑。1材料和方法1.1供試菌種及培養(yǎng)基材料:不同成熟度的市售鮮香蕉(品種:芝麻蕉,產(chǎn)地:海南)。未成熟香蕉皮用青香蕉皮表示,成熟香蕉皮用黃香蕉皮表示,過熟香蕉皮用黑香蕉皮表示。藥品:丙酮、磷鉬酸、鎢酸鈉、磷酸、單寧酸等,均為分析純試劑。供試菌種:細(xì)菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus);霉菌為黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(Aspergilusflaus);酵母菌為啤酒酵母(Saccharomyescerevisiue),均由淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院微生物實驗室提供。培養(yǎng)基:細(xì)菌用培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;霉菌、酵母菌用培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。1.2正交試驗的設(shè)計將鮮青香蕉皮經(jīng)清洗、去雜、滅酶后準(zhǔn)確稱取10g,移入圓底燒瓶,以丙酮-水體系為提取液進(jìn)行提取。選L9(33)做正交試驗,確定提取香蕉皮中單寧的最佳工藝參數(shù)。選取的因素及水平如表1。試驗時在水浴狀態(tài)下進(jìn)行回流提取,將提取液過濾,濃縮成濃度為1.0%的溶液待用。1.3準(zhǔn)溶液配制采用磷鉬酸-磷鎢酸比色法(F-D法)進(jìn)行測定。(1)F-D試劑配制:750ml水中加入鎢酸鈉100g、磷鉬酸20g、磷酸50ml,回流2h,冷卻至室溫,并稀釋為1L。(2)單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:稱取單寧酸50mg于50ml容量瓶中,加蒸餾水溶解并定容至刻度,混勻,再用蒸餾水稀釋10倍即為0.1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。(3)單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:吸取單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml,分別置于盛有30ml蒸餾水的50ml容量瓶中,加F-D試劑2.5ml及飽和Na2CO3溶液5ml,加水稀釋至50ml。充分混合,并于30min后在650nm處測定吸光度值。記錄吸光度值,并對單寧酸體積(ml)作圖。(4)樣品測定:吸取待測樣品液,與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同方法測定,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀取樣品中單寧的含量,測定不同成熟度香蕉皮單寧含量。1.4香香蕉皮的單次抗菌效果的測定1.4.1菌種懸浮液的制備將相應(yīng)的菌種接到斜面培養(yǎng)基上,細(xì)菌在(37±1)℃下恒溫培養(yǎng)24h,霉菌和酵母菌于(28±1)℃下恒溫培養(yǎng)48h,連續(xù)培養(yǎng)3次,以無菌生理鹽水配制成孢子或菌體懸浮液,濃度為106～107CFU/ml,備用。1.4.2保鮮液用量的確定采用濾紙片法,以無菌生理鹽水和0.5%山梨酸鉀水溶液作為對照。將直徑為6mm的濾紙片160℃干熱滅菌后置于0.5%的提取液中浸泡24h,并用無菌水和0.5%山梨酸鉀水溶液作為對照,進(jìn)行相同處理。將制備好的菌懸液0.2ml滴入到已倒有相應(yīng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,涂布均勻,用無菌鑷子將濾紙片放入含菌平皿中,每皿4片,每種菌做3個重復(fù),分別放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),測量各供試菌的抑菌圈直徑,取平均值。1.4.3決定是否患有抗菌試驗以抑菌圈直徑大于6mm者評價為有抑菌作用,無菌水對照組應(yīng)無抑菌圈產(chǎn)生,否則試驗無效。無菌水對照組所測直徑為濾紙片直徑。1.4.4培養(yǎng)基的制備將制備好的液體培養(yǎng)基121℃下濕熱滅菌30min,冷卻至50℃后以每試管10ml進(jìn)行分裝,將單寧粗提物配制成0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%和1.0%系列濃度的單寧培養(yǎng)基,每1系列接種1種菌,每個濃度做3個重復(fù),置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),另取無菌水作對照。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)物與空白對照在紫外可見掃描儀上進(jìn)行比色測定,以二者吸光度基本相同,即培養(yǎng)基中沒有菌落生長的最低濃度為香蕉皮中單寧的最低抑菌濃度。2結(jié)果與分析2.1鮮香蕉皮提取物提取測得單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和香蕉皮中單寧的提取率公式分別為:Y=0.0879X-0.015,r=0.9988單寧提取率=P×V1V2×m×100%=Ρ×V1V2×m×100%式中,Y為單寧在650nm波長處測定的吸光度;X為相當(dāng)于0.1mg/ml單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(ml);m為鮮香蕉皮的質(zhì)量(mg);V1為提取液總體積(ml);V2為比色時所吸提取液體積(ml);P為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的提取液所含單寧(mg)。2.2單因素對香蕉皮單株提取率的影響以青香蕉皮為試驗材料進(jìn)行提取,由極差分析(表2)可知,影響香蕉皮單寧提取率的各因素的主次關(guān)系依次為浸提溫度(A)>料液比(C)>浸提時間(B),說明溫度對單寧提取率影響最大,其次是料液比,最后是浸提時間。同時由表3方差分析可見,在1%顯著水平上,浸提溫度(A)和料液比(C)對單寧提取率的影響極為顯著,而浸提時間(B)對單寧提取率的影響不顯著。香蕉皮單寧提取的最適組合為A2B2C3,即提取溫度60℃,提取時間10h,料液比1∶14。由表4可知,香蕉皮中的單寧含量并不高,總均提取率在0.588%左右(波動在0.283%～0.933%之間)。在統(tǒng)計學(xué)水平上有如下結(jié)論:在1%顯著水平上,各成熟度香蕉皮間單寧含量均有極顯著差異,提取量最大的青香蕉皮單寧含量0.882%,提取量最低的黑色香蕉皮單寧含量0.304%,下降了0.578個百分點。2.3香香蕉皮的獨特抗菌效果把香蕉皮單寧提取液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮,經(jīng)感官鑒定,為黃褐色的黏稠固體,完全干燥后為黃色粉末,有特殊的香味。2.3.1啤酒酵母的抑菌效果由表5可知,香蕉皮單寧提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌以及枯草芽孢桿菌的抑制效果非常強,抑菌圈直徑達(dá)到13.51mm;對啤酒酵母的抑制效果差,無抑菌圈產(chǎn)生;對黑曲霉及黃曲霉的抑制作用較差,抑菌圈直徑在6.85mm左右。山梨酸鉀與之相比,對細(xì)菌的抑制效果差,抑菌圈直徑僅在7.53mm左右;對真菌的抑制效果則強于香蕉皮單寧提取物,抑菌圈直徑達(dá)到了13.55mm。提示香蕉皮單寧提取物可以用于抑制細(xì)菌性2.3.2菌株mic的測定由表6可見,香蕉皮單寧提取物對細(xì)菌的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真菌:對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為0.1%,對枯草芽孢桿菌的MIC是0.2%,對黑曲霉和黃曲霉的MIC為1.0%,對啤酒酵母的MIC超過1.0%。這一試驗結(jié)果進(jìn)一步驗證了濾紙片法的測定結(jié)果。3廢棄物的提取量與其他一些植物果實相比,香蕉皮中的單寧含量不高,僅在0.588%左右,而黑棗中的單寧含量達(dá)2.82%,葡萄籽中單寧含量達(dá)23%,石榴皮中的單寧含量達(dá)到了80.33%,這與被提取的原料有極大的關(guān)系。雖然香蕉皮中的單寧含量不高,由于香蕉皮作為廢棄物資源極為豐富,提取量仍很可觀。有資料顯示,單寧的抗微生物作用機制主要是由于單寧能夠與酶作用形成復(fù)合物,抑制微生物酶的活性;另外,單寧還可以作用于微生物細(xì)胞膜與微生物細(xì)胞膜抑制電子中繼系統(tǒng)有關(guān),會對微生物膜造成一定的損傷。山梨酸鉀為酸性防腐劑,山梨酸鉀對霉菌和酵母菌的抑制作用強于對細(xì)菌的抑制作用,能有效地抑制霉菌、酵母菌和好氧性細(xì)菌的活性,還能防止肉毒桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌等有害微生物的生長和繁殖。本研究的結(jié)果表明,山梨酸鉀對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌的抑制作用遠(yuǎn)低于單寧提取物,而對受試黃曲霉和黑曲霉以及啤酒酵母的抑制效果較好,遠(yuǎn)強于香蕉皮單寧提取物。因此,在防腐劑的制備過程中,可考慮將天然提取物單寧和山梨酸鉀等化學(xué)防腐劑進(jìn)行復(fù)配,對防止食物中毒和食品保藏方面會有廣闊的應(yīng)用前景。4香蕉皮有機溶劑提取香蕉皮單寧提取過程中,影響提取率的各因素的主次關(guān)系依次為浸提溫度(A)>料液比(C)>浸提時間(B),最佳提取條件為:提取溫度60℃,提取時間10h,料液比1g∶14ml。香蕉皮中的單寧含量并不高,提取率僅在0.588%左右。不