啤酒廢酵母核糖核酸提取工藝研究

啤酒廢酵母核糖核酸提取工藝研究

核糖酸（rn）是生物中的高氧化劑。它不僅在表達(dá)基因和轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用，而且在促進(jìn)許多生理功能方面也發(fā)揮著重要作用。核糖核酸和它的降解物核苷酸、核苷及其衍生物不僅是生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的重要試劑,而且在食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中亦有著很廣泛的應(yīng)用。微生物中RNA含量最豐富的是酵母,19世紀(jì)末,HAMMARS從酵母中提取出不含蛋白質(zhì)的RNA。工業(yè)原料用的RNA主要是從酵母中提取的。作為啤酒工業(yè)廢棄物之一的啤酒廢酵母,其RNA含量達(dá)4%~8%,是很好的工業(yè)上提取RNA的原料。從啤酒酵母中提取RNA的工藝方法很多,初期階段常用堿法,但是RNA在酸或堿中不穩(wěn)定,故若需獲得未降解狀態(tài)的RNA,應(yīng)盡量避免使用酸或堿。另外該方法抽提的終點(diǎn)很難控制,雖然該法抽提的優(yōu)點(diǎn)是成本低、耗能少。近年來也有利用氨解法抽提RNA的,不過此法抽提的酵母RNA抽提率和純度都很低,而且氨對(duì)人體有刺激作用。工業(yè)上通常利用鹽法提取酵母RNA。在酵母RNA的制品中含有1%~3%的DNA,但利用鹽法提取酵母RNA時(shí),將提取液的pH值調(diào)為4~5,便可制得DNA含量更低的RNA產(chǎn)品。另外鹽法的抽提溫度高,可將蛋白變性與酵母渣一起除去,提高了RNA產(chǎn)品的品質(zhì)。但是濃鹽法與稀堿法相比,提取率偏低,因此有必要對(duì)濃鹽法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,提高抽提率。在本試驗(yàn)主要探討了濃鹽法從啤酒廢酵母中提取核糖核酸的工藝。1材料和方法1.1原材料啤酒廢酵母泥:華潤(rùn)雪花啤酒(無錫)有限公司,核糖核酸含量為6%~8%。1.2主試劑鹽酸、高氯酸、鉬酸銨、氯化鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、氨水等均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3儀器和離心分離機(jī)100目分樣篩:浙江上虞哨金五四紗篩廠;PL2002電子天平:METTLERTOLEDO公司;EL204電子天平:MET-TLERTOLEDO公司;電熱恒溫水浴鍋:上海醫(yī)療器械五廠;PHS-3C精密pH計(jì):上海雷磁儀器廠;UV-2100紫外可見分光光度計(jì):龍尼科(上海)儀器有限公司;LD4-2A離心分離機(jī):北京醫(yī)用離心廠;TGL-16C離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠。1.4方法1.4.1酵母泥的預(yù)處理啤酒經(jīng)發(fā)酵后回收的廢酵母泥中含有酒花顆粒沉淀和析出的蛋白質(zhì)沉淀等物質(zhì),同時(shí)在釀造過程中,由于一些酒花顆粒及代謝產(chǎn)物吸附在酵母上,酵母泥呈淡咖啡色,并帶有苦味和令人不愉快的酵母味道,這些都會(huì)對(duì)核糖核酸成品產(chǎn)生不良影響。因此在提取之前,酵母泥必須經(jīng)過洗滌、除雜及脫苦等處理。目前主要的預(yù)處理方法有:(1)選用親水性有機(jī)溶劑乙酸乙酯處理脫掉;(2)加入酒石酸或食用小蘇打等方法除去。通過試驗(yàn)分析比較,采用加0.5%的NaHCO3的方法進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理過程:啤酒廢酵母→10%酵母懸液→過100目篩子2次,除去大分子雜→4000r/min離心10min→加0.5%的NaHCO3洗滌0.5h,除苦味→4000r/min離心10min→酵母泥用清水充分分散洗滌離心2次→棄上清液得含水量80%左右的酵母泥。1.4.2紫外分光光度法啤酒廢酵母中核糖核酸的測(cè)定——高氯酸法:稱取一定質(zhì)量的處理好的酵母泥,加入2mL生理鹽水渦旋振勻后加入2mL10%高氯酸溶液搖勻,水浴70℃保溫20min(5min搖勻1次)。將溶液10000r/min離心5min,取上清液稀釋一定的倍數(shù),波長(zhǎng)260nm處測(cè)定吸光度值,以0.1%高氯酸作空白。式中:0.024是濃度為1μg/mL的RNA溶液的OD值。上清液中核糖核酸的測(cè)定:紫外分光光度法。提取核酸的純度計(jì)算:純RNA溶液的OD260/OD280比值為2.0,由于蛋白的最大吸收峰為280nm,若樣品中含有蛋白質(zhì),則OD260/OD280比值將下降,若含有單核苷酸,則OD260/OD280比值將增大。因此核糖核酸樣品的純度通常可用OD260/OD280比值來判斷。2結(jié)果與討論2.1因素的確定及濃度的確定在前人所做研究的基礎(chǔ)上初步確定了提取工藝各因素的范圍為提取時(shí)間2h~6h,提取溫度85℃~105℃,氯化鈉濃度6%~12%,酵母濃度6%~12%。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了單因素試驗(yàn)。2.1.1rna抽提率試驗(yàn)取上述處理的酵母泥,定容成10%酵母濃度,加入氯化鈉的量為10%,90℃水浴保溫時(shí)間0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、5.5h、6.0h、6.5h,冷卻后離心,測(cè)定上清液中RNA抽提率、收率及OD260/OD280。由圖1可知,當(dāng)提取時(shí)間在5h~5.5h時(shí)RNA的抽提率和收率達(dá)到最高,并且此時(shí)OD260/OD280值也更接近2.0,說明樣品的純度也很高。此后再延長(zhǎng)提取時(shí)間,RNA的提取率與收率反而下降,因此后續(xù)試驗(yàn)控制提取時(shí)間為5.5h。2.1.2rna抽提率測(cè)定取上述處理的酵母泥,定容成10%酵母濃度,加入氯化鈉的量為10%,分別在85℃、90℃、95℃、100℃水浴中保溫時(shí)間5.5h,冷卻后離心,測(cè)定上清液中RNA抽提率、收率及OD260/OD280。由圖2可知,隨著溫度的提高,RNA的提取率和收率明顯提高,100℃時(shí)達(dá)到最大,此后溫度對(duì)提取量影響甚微,OD260/OD280值隨溫度升高逐漸接近于2.0,100℃后趨于穩(wěn)定,故后續(xù)試驗(yàn)采用的提取溫度為100℃。2.1.3鹽濃度對(duì)rna提取率的影響取上述處理的酵母泥,定容成10%酵母濃度,分別加入氯化鈉的量4%、6%、8%、10%、12%,在100℃水浴中保溫時(shí)間5.5h,冷卻后離心,測(cè)定上清液中RNA抽提率、收率及OD260/OD280。由圖3可知,氯化鈉濃度為10%時(shí)RNA的抽提率和收率最高,此后氯化鈉的量再增加,RNA的提取率基本不變;而OD260/OD280值隨著鹽濃度的增加遠(yuǎn)離2.0,在氯化鈉濃度超過8%時(shí)呈現(xiàn)較快增大的趨勢(shì),說明RNA溶液的純度迅速降低。綜合考慮以上因素,取氯化鈉濃度為8%~10%。2.1.4rna抽提率、收率及od20/od320分別取一定量的處理好的酵母,定容成6%、8%、10%、12%的酵母濃度,加入氯化鈉的量為10%,100℃下保溫5.5h,冷卻后離心,測(cè)定上清液中RNA抽提率、收率及OD260/OD280。由圖4可知,酵母濃度越低,RNA的抽提率和收率越高,但是酵母濃度太低時(shí)工業(yè)上并不適用,因此酵母濃度要適當(dāng)提高;另外由圖可以看出,酵母濃度超過8%后OD260/OD280值迅速增大偏離2.0,說明純度受到較大影響。并且在酵母濃度達(dá)8%時(shí)RNA收率已經(jīng)很高,達(dá)到了93.38%。因此,這里取酵母濃度為8%。2.2正交試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)一個(gè)L9(33)正交試驗(yàn),試驗(yàn)方案見表1,試驗(yàn)結(jié)果見表2,方差分析見表3。由表2、表3可知,因素X2即反應(yīng)溫度為最顯著影響因子,其次是酵母濃度和氯化鈉濃度,影響最小的是反應(yīng)時(shí)間,這與單因素試驗(yàn)的結(jié)果基本吻合。最佳提取工藝為A2B3C2D1,即反應(yīng)時(shí)間5h,反應(yīng)溫度100℃,氯化鈉濃度8%,酵母濃度8%。在正交試驗(yàn)結(jié)果中無此項(xiàng),因此在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),測(cè)得RNA的抽提率為6.68%,收率為94.08%,OD260/OD280為2.01。3反應(yīng)溫度對(duì)rna提取效果的影響通過對(duì)RNA提取條件的研究