啤酒廢酵母中分離純化谷胱甘肽的研究

啤酒廢酵母中分離純化谷胱甘肽的研究

金屬離子親和色譜法是一種新興的親和色度技術(shù)。其原理是將金屬離子與蛋白質(zhì)表面的cu2、t2、zn2、ni2和其他通道離子結(jié)合起來，將金屬離子轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)表面。由于蛋白質(zhì)表面中氨基酸的類型、數(shù)量、位置和空間結(jié)構(gòu)的不同，因此這些氨基酸與金屬鉤子之間的親和力不同，因此可以選擇分離和提取。谷胱甘肽化學(xué)名為：N-（N-L-γ-Glutamyl-L-cysteninyl)glycine，即N-{N-L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰}甘氨酸。谷胱甘肽（glutathione,GSH）是細(xì)胞內(nèi)含巰基非蛋白質(zhì)化合物，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)、保護(hù)蛋白質(zhì)及酶分子免受內(nèi)源性氧化作用，維持其功能狀態(tài)。臨床用于中毒性肝炎和感染性肝炎治療，有機(jī)物及重金屬的解毒，癌癥輻射和化療的保護(hù)；亦廣泛用于食品加工業(yè)；為強(qiáng)化抗癌系列飲料的醫(yī)療效果，已有人申請(qǐng)并獲得了釀造高谷胱甘肽含量的抗癌系列啤酒的專利。本研究是從啤酒廢酵母中分離純化谷胱甘肽。通過對(duì)啤酒廢酵母的預(yù)處理及細(xì)胞的破碎，得到富含谷胱甘肽的酵母抽提液。以殼聚糖為載體，Cu2+為配基，經(jīng)過一系列處理制成金屬螯合層析劑，再將不同pH的谷胱甘肽抽提液上柱，以堿性溶液洗脫，以找到洗脫率最高時(shí)的上柱pH及洗脫液濃度。1材料和設(shè)備1.1材料表面啤酒廢酵母抽提液：由抽提液制備組提供。殼聚糖：市售，分子量270KD脫乙酰度87.22%。1.2主試劑偏磷酸、碘酸鉀、環(huán)氧氯丙烷、硼氫化鈉、戊二醛、亞氨基二乙酸鈉均為分析純。1.3復(fù)合蒸發(fā)器JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A：上海亞榮生化儀器廠。722可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。1.4分析還原型谷胱甘肽：碘量法測(cè)定。2測(cè)試方法2.1工藝2.2殼聚糖液的制備將2g殼聚糖溶于100mL1%的醋酸，快速攪拌30min后以細(xì)長(zhǎng)滴管吸取液體，滴入30%～40%的NaOH溶液，形成乳白色中空的殼聚糖小球。水洗至中性，再以丙酮洗去水。加入戊二醛溶液，快速攪拌交聯(lián)6h；水洗至中性后，加入硼氫化鈉溶液攪拌30min以去除多余的醛基；水洗小球至中性并以丙酮去水，調(diào)懸液pH為12。再加入環(huán)氧氯丙烷攪拌交聯(lián)4h，水洗至中性后去水，按活化殼聚糖比例加入亞氨基二乙酸鈉，在65℃水浴中保溫24h后洗滌至中性備用。將上述殼聚糖小球連同水一起裝入15mm□500mm的層析柱中，保證裝柱時(shí)無氣泡產(chǎn)生，并一直有水覆蓋在小球表面。將0.1mol/L的硫酸銅溶液灌入層析柱中，逐次收集流出液。檢驗(yàn)流出液中的Cu2+含量，直至流出液中Cu2+含量基本不變?yōu)橹?，說明此時(shí)層析柱中Cu2+含量已達(dá)飽和。然后計(jì)算其螯合率。上柱Cu2+的質(zhì)量=（10mL上柱硫酸銅溶液的質(zhì)量-10mL流出的硫酸銅溶液的質(zhì)量）□上柱的硫酸銅溶液總體積/10mL2.3啤酒廢酵母抽提液上柱預(yù)處理調(diào)整不同的上柱pH值，計(jì)算各種條件下的谷胱甘肽回收率，以確定最佳上柱pH值。將層析柱以蒸餾水洗至中性后，將啤酒廢酵母抽提液上柱，再以蒸餾水洗柱至中性。經(jīng)0.25mol/L的NaOH溶液洗脫，收集排放物，測(cè)定排放物中谷胱甘肽的含量，計(jì)算回收率。2.3.1計(jì)算回收率結(jié)果采用pH2.0﹑pH2.5﹑pH3.0﹑pH3.5的樣品上柱，計(jì)算回收率，確定最高回收率時(shí)的上柱樣品pH值。注：由于本次實(shí)驗(yàn)所用層析柱較小，故應(yīng)調(diào)節(jié)啤酒廢酵母抽提液濃度，必要時(shí)可進(jìn)行稀釋。2.3.2naoh溶液洗脫選用濃度分別為0.10mol/L、0.15mol/L、0.20mol/L、0.25mol/L、0.30mol/L的NaOH溶液洗脫。計(jì)算回收率，確定最高回收率時(shí)的上柱樣品pH值。3結(jié)果與分析3.1cuso4分光光度法將制備試驗(yàn)獲得黃褐色的韌性和穩(wěn)定性較好的殼聚糖小球裝柱，待流過層析柱的CuSO4溶液達(dá)400mL后，以試管逐次收集流出層析柱的CuSO4溶液，分別以722分光光度計(jì)測(cè)定。以蒸餾水調(diào)零，當(dāng)吸收值趨于平穩(wěn)時(shí)，可認(rèn)為螯合Cu2+程度已至飽和。采用480nm光源時(shí)，得到結(jié)果見表1。從表1可以看出，吸收值基本保持不變，說明柱子上螯合的Cu2+已達(dá)飽和狀態(tài)。3.2上柱cu2+的量由于Cu2+被螯合上柱，故上柱前后CuSO4的質(zhì)量差較明顯，故采用電光分析天平稱量的方法來確定上柱螯合的Cu2+的量。以2組干燥的稱量瓶分別盛放0.1mol/LCuSO4溶液和流出層析柱的CuSO4溶液，每個(gè)稱量瓶分別盛放10mL，分別進(jìn)行稱量，2組稱量瓶的稱量結(jié)果差即為上柱Cu2+的量。結(jié)果見表2。即上柱螯合Cu2+的量為：（10.0657-10.0584）×400/10=0.292(g)3.3次佳上柱ph值試驗(yàn)選用了4種不同的上樣pH值，共進(jìn)行8次佳上柱pH值。其試驗(yàn)結(jié)果平均值見表3。由表3可知，試驗(yàn)結(jié)果pH3.0為上柱最適pH值，其谷胱甘肽回收率為61.39%。3.4谷胱甘肽回收率試驗(yàn)選用濃度分別為0.10mol/L、0.15mol/L、0.20mol/L、0.25mol/L、0.30mol/L的NaOH溶液洗脫。選擇谷胱甘肽回收率最大時(shí)的NaOH溶液濃度為洗脫液濃度。試驗(yàn)結(jié)果見表4。從表4可知，當(dāng)NaOH洗脫液濃度為0.25mol/L時(shí)，GSH回收率達(dá)到最大為65.59%。4cu2+與亞氨基二乙酸鈉為金屬螯合劑的谷胱甘肽分離純化結(jié)果以殼聚糖為載體的親和層析試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)上柱樣品pH為3.0時(shí)，谷胱甘肽回收率達(dá)到最大，為61.39%；當(dāng)NaOH洗脫液濃度為0.25mol/L時(shí)，谷胱甘肽洗脫率達(dá)到最大，為65.59%。利用安全、無毒、天然殼聚糖為載體，Cu2+為配基，以戊二