酵母雙雜交系統(tǒng)從人外周血白細(xì)胞cd-na文檔中篩選與轉(zhuǎn)錄因子foxp3相互作用的蛋白

酵母雙雜交系統(tǒng)從人外周血白細(xì)胞cd-na文檔中篩選與轉(zhuǎn)錄因子foxp3相互作用的蛋白

c4-sd25（tregs）是維持身體免疫穩(wěn)定并防止自身免疫性疾病的重要因素。其中，領(lǐng)主因素是誘導(dǎo)cd4-cd25和tregs細(xì)胞發(fā)育和生物學(xué)功能的主要調(diào)節(jié)因素。Foxp3作為轉(zhuǎn)錄因子并不是直接調(diào)節(jié)靶基因,而是通過與其他分子形成超分子復(fù)合體共同調(diào)控一些基因的轉(zhuǎn)錄。所以,了解Foxp3的相互作用分子對于闡明其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制具有重要的意義。酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白間相互作用的有力手段不同,但是篩選的文庫不同獲得的互作蛋白也不相同。目前,已知的Foxp3相互作用分子有NFAT、NF-кB、AP-1、AML1/Runx1、RORγt和TIP60。這些分子尚不能充分闡明Foxp3在Tregs發(fā)育過程中的生物學(xué)功能,所以有必要再次尋找新的Foxp3相互蛋白。人Foxp3基因包含11個(gè)外顯子,編碼431個(gè)氨基酸,相對分子質(zhì)量(Mr)為48000,但是Westernblot結(jié)果顯示兩條特異性條帶出現(xiàn),其中另一條帶的Mr約為4000。我們課題組通過RT-PCR從正常人外周血中獲得Foxp3第二外顯子缺陷突變體Foxp3△2(△2代表外顯子2未轉(zhuǎn)錄),研究證明Foxp3△2突變體和Foxp3全長分子在同一個(gè)體內(nèi)同時(shí)存在,同樣具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。研究證明引起IPEX(immunodysregulationpolyendocrinopathyenteropathyX-linkedsyndrome)綜合征的突變位點(diǎn)均在缺失的外顯子2之外,充分說明外顯子2編碼的氨基酸(71-105aa)在Foxp3的功能發(fā)揮中是不必要的。所以通過Foxp3△2相互作用分子及其功能的闡明,可為深入研究Foxp3的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究以Foxp3△2為誘餌蛋白,構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-Foxp3△2,從包含Tregs的人外周血白細(xì)胞cDNA文庫中篩選出新的Foxp3相互作用分子,為目前Foxp3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制的研究提供新的途徑。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和試劑酵母表達(dá)載體pGBKT7,由本校病理與病理生理學(xué)教研室閔婕博士贈送。酵母表達(dá)載體pGADT7,本校遺傳與發(fā)育學(xué)教研室韓驊教授贈送。酵母菌AH109,購自美國Clontech公司。感受態(tài)細(xì)菌E.coliDH5α,由本室保存。-Ade-His-Trp-Leu營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、-Trp-Leu營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、-His營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、-Leu營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、-Trp營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、-Ura營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、SD酵母基礎(chǔ)培養(yǎng)基、X-α-gal、YPD酵母培養(yǎng)基、腺嘌呤(Ade)和鮭魚精DNA均購自美國Clontech公司。β-巰基乙醇購自美國Gibco公司。DMSO和PEG3350購自美國Sigma公司。DNAmarkerDL2000、PCR試劑盒、T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶均購自日本TaKaRa生物公司。酵母提取物、胰蛋白胨購自英國Oxoid公司。X-gal購自西安潤德生物技術(shù)有限公司。膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物技術(shù)責(zé)任有限公司。氨芐青霉素及硫酸卡那霉素購自中國華北制藥有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。1.2方法1.2.1pcr擴(kuò)增劑的設(shè)計(jì)抽取肝素抗凝靜脈血10mL(1名中國健康男子自愿者),用無血清RPMI1640培養(yǎng)液等比例混勻后,小心加入含20mL人淋巴細(xì)胞分離液的50mL體積離心管中,將外周血置于淋巴細(xì)胞分離液層面之上,2000r/min,室溫離心20min,收集第二層為環(huán)狀乳白色的單個(gè)核細(xì)胞。按TRIzol一步法提取mRNA。利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒,按照5×primescriptTMbuffer4μL,primescriptTMRTenzymemix1μL,Oligo(dT)primer1μL,TotalRNA10μL,RNasefreeH2O4μL的比例配制20μL總體系,37℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15min,85℃孵育5s合成cDNA。然后進(jìn)行巢式PCR反應(yīng),根據(jù)GenBank公布人Foxp3序列(GenBankIDDQ010327)設(shè)計(jì)巢式PCR引物,其中一對內(nèi)引物擴(kuò)增Foxp3△2cDNA序列,結(jié)合酵母表達(dá)載體pGBKT7開放讀框的多克隆位點(diǎn),同時(shí)在上下游內(nèi)引物5′端分別插入EcoRⅠ及SalⅠ酶切位點(diǎn),設(shè)計(jì)引物序列如下,并由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。5′-AGTCCACTTCACCAAGCCTG-3′(外正),5′-AAGGAGGATGGACGAACAG-3′(外反),5′-CGGAATTCAT-GCCCAACCCCAGGCCTGGC-3′(內(nèi)正),5′-CGGTCGACTCAG-GGGCCAGGTGTAGGGTTG-3′(內(nèi)反)。以cDNA為模板,以一對外引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增,體系為:cDNA1μL,2×PCRMix12.5μL,dH2O9.5μL,正反外引物各1μL(總體積25μL)95℃變性5min,循環(huán)條件:94℃30s,58℃30s,72℃2min,30個(gè)循環(huán)后72℃10min;隨后以第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物為模板,取1μL,以一對內(nèi)引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增,將退火溫度升至62℃,其余條件不變。1.2.2pgbkt7-長期耐藥試驗(yàn)將第2輪PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切后插入到已經(jīng)相應(yīng)酶切處理的pGBKT7中,構(gòu)建酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-Foxp3△2。1.2.3sd/-trp平板上的生長情況同時(shí)將重組子pGBKT7-Foxp3△2和空載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母菌AH109,觀察其SD/-Trp平板上的生長情況;挑選轉(zhuǎn)化有pGBKT7-Foxp3△2和pGBKT7的單克隆分別劃線接種至SD/-Trp、SD/-His、SD/-Leu、SD/-Ura及SD/-Trp/X-a-gal平板,于30℃培養(yǎng)48h,觀察菌落生長情況及菌落顏色的變化。1.2.4生物活性化合物的純化選用QIAGENPlasmidPurificationMegaKit進(jìn)行cDNA文庫質(zhì)粒的大量抽提。取純化的文庫質(zhì)粒1μL轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,在含氨芐青霉素100mg/L的LB瓊脂板上置37℃孵育14~16h。隨機(jī)挑取16個(gè)單克隆,擴(kuò)增并提取質(zhì)粒,用EcoRI/XhoI雙酶切鑒定。1.2.5酵母細(xì)胞的培養(yǎng)用醋酸鋰法將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Foxp3△2與cDNA文庫質(zhì)粒(克隆在pACT2中)共同轉(zhuǎn)化酵母AH109,之后將酵母細(xì)胞涂布于SD/-Leu-Trp雙缺平板上,置于30℃孵箱中培養(yǎng)約3~5d。挑取所有的單菌落克隆,在含有X-α-gal的SD/-Trp-Leu-His-Ura四缺平板上劃線(讓含有多個(gè)質(zhì)粒的酵母菌隨著分裂分布到不同的酵母菌中去),重復(fù)3次后,挑選依然呈現(xiàn)藍(lán)色的克隆,進(jìn)行β-半乳糖苷酶檢測。1.2.6基因序列的測量和分析將排出假陽性后的文庫質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/Xho2結(jié)果2.1酶切鑒定及測序分析運(yùn)用巢氏PCR方法由正常人外周血PBMC中獲得Foxp3△2基因,經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切后將其重組到pGBKT7中,酶切鑒定及測序分析表明,Foxp3△2插入方向及閱讀框架均無誤(圖1)。為了確定構(gòu)建的pGBKT7-Foxp3△2能在酵母中正確表達(dá),我們將pGBKT7-Foxp3△2轉(zhuǎn)染AH109,pGBKT7轉(zhuǎn)染AH109作為對照,應(yīng)用Foxp3△2抗體進(jìn)行Westernblot檢測,可見Foxp3△2的蛋白表達(dá),證明Foxp3△2能在酵母中表達(dá)(圖2)。2.2誘變劑的篩選AH109酵母菌含有尿嘧啶缺陷篩選基因,轉(zhuǎn)化了pGBKT7-Foxp3△2的AH109在SD/-Ura培養(yǎng)基上生長良好,說明轉(zhuǎn)化所用酵母品系確為AH109并且Foxp3△2的表達(dá)對酵母菌無毒性作用;pGBKT7質(zhì)粒含有色氨酸缺陷篩選基因,SD/-Trp平板上菌落生長說明誘餌質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入AH109中;同時(shí)SD/-Leu平板上無菌落生長說明無文庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入;而組氨酸缺陷篩選基因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所用GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)的報(bào)告基因,故在SD/-His平板上無菌落生長表明誘餌載體無自激活作用(圖3A)。編碼α-半乳糖苷酶的MEL1基因也是本實(shí)驗(yàn)所用GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)顏色篩選的報(bào)告基因,系統(tǒng)以pCL1質(zhì)粒為陽性對照,該質(zhì)粒中含有野生型全長GAL4基因,可以激活下游MEL1基因,使α-半乳糖苷酶含量增加,分解底物X-α-gal,因而使菌落變藍(lán)。pGBKT7-Lam質(zhì)粒為陰性對照。結(jié)果顯示pGBKT7-Foxp3△2/AH109菌落未變藍(lán),表明無自激活作用,與His報(bào)告基因檢測結(jié)果一致(圖3B)。2.3初支型文庫擴(kuò)增后進(jìn)行大提質(zhì)粒,共獲得4mL質(zhì)粒,濃度為0.375g/L(A260/280=1.8)。取1μL轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài),在LB/amp+平板上隨機(jī)挑選16個(gè)陽性克隆抽提質(zhì)粒,用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定,結(jié)果顯示所挑文庫質(zhì)粒均有插入,插入片段大小分布在400-4000bp之間,說明文庫的多樣性較好(圖4)。2.4ura四缺平板上的菌落培養(yǎng)從轉(zhuǎn)化子文庫取20μL酵母菌液,鋪于含有X-α-gal的SD/-Trp-Leu-His-Ura四缺平板上。置于30℃孵箱中培養(yǎng)3-5d至菌落生成。挑取呈蘭色的菌落128個(gè),在含有X-α-gal的SD/-Trp-Leu-His-Ura四缺平板上劃線分離,重復(fù)3次。經(jīng)過α半乳糖苷酶篩選陽性的克隆再經(jīng)過兩次的β半乳糖苷酶活性檢測,最終獲得了40個(gè)藍(lán)色克隆(圖5)。2.5選擇陽性克隆的酶切將陽性質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,可以看到不同大小的cDNA文庫片段(圖6)。2.6缺失基因片段的檢測對上述陽性的克隆進(jìn)行測序分析,再經(jīng)BLAST核苷酸相似性分析,在40個(gè)陽性克隆中,有9種具有開放讀框,包括半乳糖凝集素1(Galectin-1)、泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄子(UXT)、淋巴毒素β(LTB)、無花果酶(FCN1)、視網(wǎng)膜特異蛋白(f379)、肌動(dòng)蛋白(ACTB)、羧肽酶(PASP)、同源域結(jié)合蛋白激酶1(HIPK1)、真核翻譯啟動(dòng)因子3(EIF3S2),其他均為未知基因片段。3強(qiáng)化細(xì)胞內(nèi)與氧合2的相互作用的分子CD4+CD25+Tregs具有天然的無反應(yīng)性及免疫抑制能力,對IL-2、特異性抗原、抗原提呈細(xì)胞(APC)的刺激呈無反應(yīng)狀態(tài),能抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的IL-2轉(zhuǎn)錄與表達(dá),從而干擾其活化與增殖,它還可以抑制CD4+CD25-T細(xì)胞對IL-2的反應(yīng)性,干擾CD4+Th細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞的輔助作用。例如CD4+CD25+Tregs數(shù)量減少或功能降低將導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生,與CD4+CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞(Teff)混合培養(yǎng)可以抑制Teff的增殖。正是由于CD4+CD25+Tregs在外周能夠抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活性,從而維持機(jī)體免疫穩(wěn)定,控制自身免疫性疾病的發(fā)生,所以CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在機(jī)體產(chǎn)生外周免疫耐受和免疫自穩(wěn)中發(fā)揮重要的作用。Foxp3在CD4+CD25+Tregs的發(fā)育和生物學(xué)功能發(fā)揮中起著重要的作用,具有下調(diào)免疫應(yīng)答的功能。但是,Foxp3是通過何種途徑及機(jī)制調(diào)控了其下游分子的表達(dá),目前仍是免疫學(xué)領(lǐng)域探討的熱點(diǎn)問題。鑒于絕大多數(shù)分子在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行功能都是通過蛋白與蛋白之間的相互作用來實(shí)現(xiàn),因此相互作用分子的研究可為其調(diào)控機(jī)制的闡明提供線索,而且目前的研究也提示Foxp3作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子并不是直接調(diào)控下游基因,而是與其他分子形成復(fù)合物共同發(fā)揮作用,所以,進(jìn)一步尋找淋巴細(xì)胞內(nèi)與Foxp3相互作用的新分子可為進(jìn)一步闡明其調(diào)節(jié)機(jī)制提供新線索。酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白間相互作用的有力手段,我們以Foxp3△2為誘餌蛋白,對人周血白細(xì)胞cDNA文庫進(jìn)行了篩選。實(shí)驗(yàn)中篩選出40個(gè)陽性克隆,從這些克隆中提取酵母質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌,再提取質(zhì)粒,用EcoRI和XhoI對其進(jìn)行雙酶切鑒定后,對插入片段進(jìn)行測序和BLAST核苷酸相似性分析,結(jié)果顯示9個(gè)陽性克隆具有開放讀框。本研究通過酵母雙雜交系統(tǒng)嚴(yán)格篩選獲得了與Foxp3存在相互作用的蛋白,通過分析這些已知蛋白的功能信息,為進(jìn)一步研究Foxp3的功能提供了線索。在這9個(gè)候選Foxp3△2相互作用蛋白中,泛表達(dá)轉(zhuǎn)錄子UXT屬于前折疊素樣(prefoldin)分子家族成員,定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、中心小體和細(xì)胞骨架中。有研究表明UXT的過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生相關(guān)或直接促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生,UXT的表達(dá)異常導(dǎo)致中心體的功能障礙和染色體分離障礙,最終導(dǎo)致