柚皮提取物的分離純化及其抑菌作用的初步研究

柚皮提取物的分離純化及其抑菌作用的初步研究

結(jié)果表明，葡萄柚提取物不僅對(duì)金黃色細(xì)菌、桿菌和傷寒桿菌具有較高的抗菌活性，而且對(duì)抗真菌藥物具有強(qiáng)烈的抗菌活性。Negi等人也證實(shí),葡萄柚中正己烷提取物的醇溶組分有較強(qiáng)的抑菌活性,且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌更為有效。但是對(duì)于柚皮提取物抑菌的研究,國(guó)內(nèi)仍處于探索階段,與之相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道和研究很少,僅林捷等研究了柚皮的乙酸乙酯提取物的抑菌作用。證實(shí)了其對(duì)蘇云金芽孢桿菌、卵黃色八疊球菌以及酸泡菜中分離的混合細(xì)菌有很強(qiáng)的抑制作用。研究中通過(guò)采用乙醇提取柚皮中的活性成分(主要為柚皮黃酮),選擇了幾種細(xì)菌、霉菌,對(duì)柚皮提取物的抑菌作用進(jìn)行了初步的研究,旨在為我國(guó)柚子的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1主要真菌柚皮提取物:自制,總黃酮含量為10.9%。葡萄柚原液:湖北慶生堂醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。菌種:供試大腸桿菌(Escherichiacoli)、傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphi)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、灰綠青霉(Penicilliumglaucum)均由我校畜牧獸醫(yī)學(xué)院提供。培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、葡萄糖馬鈴薯(PDA)培養(yǎng)基。1.2方法1.2.1提取液濃縮液的制備稱(chēng)取柚皮干粉200g,以60%的酒精浸提干粉2次,第1次以20∶1的料液比浸提,第2次以10∶1的料液比浸提,抽濾得到柚皮提取液。真空濃縮,得到濃縮液。將濃縮的乙醇提取液上NKA9大孔樹(shù)脂柱,用蒸餾水洗脫,至洗脫液中不在含糖,然后用60%的酒精進(jìn)行洗脫,將洗脫液重復(fù)上柱,收集60%乙醇洗脫液,回收溶劑,冷凍干燥后制得樣品。置于干燥器中備用。經(jīng)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)比色法測(cè)定,提取物中總黃酮含量為10.9%。1.2.2關(guān)于橙色提取物的抗菌活性研究1.2.2.柚子皮提取物的制備菌懸液的制備:取大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面,37℃培養(yǎng)約24h,用接種環(huán)從斜面上挑菌到100mL無(wú)菌水中制成菌懸液,稀釋10倍,并通過(guò)混平皿計(jì)數(shù),確定菌液的稀釋度,使最后的菌懸液所含活菌量在1×106~1×107?cfu/mL。接種培養(yǎng):無(wú)菌操作下,用取液器吸取相同體積的菌液和不同濃度的柚皮提取物到滅菌小離心管中,充分混勻后,迅速注入200μL到滅菌平皿中,每種濃度的柚皮提取物做2個(gè)平行,以菌液和同體積的無(wú)菌水的混合液注200μL作空白,也可直接注入菌液100μL作空白;倒入已滅菌置45℃下恒溫的培養(yǎng)基10~12mL(每次實(shí)驗(yàn)平皿中培養(yǎng)基倒入量應(yīng)保持一致),晃動(dòng)平皿使混合液充分散開(kāi),均勻分布到平皿上,待培養(yǎng)基凝固后,置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2d觀察菌落生長(zhǎng)情況,并對(duì)菌落計(jì)數(shù)。以下式計(jì)算抑菌率:抑菌率(%)=空白皿菌落數(shù)-樣品皿菌落數(shù)空白皿菌落數(shù)×100%1.2.2.設(shè)置濾紙片、培養(yǎng)基菌懸液及柚皮提取物的制備:直接用接種環(huán)挑取已經(jīng)活化好的斜面菌種到無(wú)菌水中制成菌懸液(含活菌量較大,以便抑菌實(shí)驗(yàn)中可以致密接種)。用無(wú)菌水倍比稀釋配制5%、2.5%、1%、0.5%四個(gè)濃度的柚皮提取物,用無(wú)菌水稀釋配制1∶50的葡萄柚原液。濾紙片的制備及處理:用滅菌鑷子取烘干后的滅菌濾紙片到配制好的柚皮提取物中浸2h,置30℃烘箱中烘干備用。以無(wú)菌水浸過(guò)的濾紙片做空白。接種培養(yǎng):無(wú)菌操作下,倒入滅菌過(guò)的培養(yǎng)基制成平板,將菌懸液注100μL到平板上,用涂布棒涂抹均勻后放置約30min后以無(wú)菌操作將含柚皮提取物的5.5mm濾紙片貼到培養(yǎng)基上,每個(gè)平皿貼全所有濃度及空白的濾紙片,共計(jì)6張,每種菌做2個(gè)平行;置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2d觀察測(cè)量抑菌圈直徑大小。1.2.2.ph值的確定不同pH值培養(yǎng)基的準(zhǔn)備:配制普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,分為3份,調(diào)節(jié)pH值分別為5、6、7,121℃滅菌20min備用。菌懸液制備及接種培養(yǎng):同MIC法,所用柚皮提取物濃度為1%。1.2.2.菌懸液的制備樣品的處理及制備菌懸液:取1%的柚皮提取物,用4支小離心管分裝,1支于室溫(20~25℃)下放置,另外3支分別置50℃、80℃、100℃的不同烘箱中處理2h,取出備用。以無(wú)菌水稀釋已活化好的大腸桿菌和沙門(mén)氏菌種制備含活菌量1×106~1×107?cfu/mL的菌懸液備用。接種培養(yǎng):同1.2.2.3節(jié)。1.2.2.生長(zhǎng)平板的制備霉菌菌種的活化:制備PSA培養(yǎng)基斜面,取黑曲霉、米曲霉、青霉菌種接種到斜面上活化24h,取活化菌再次接種到斜面上進(jìn)行2次活化48h,備用。接種培養(yǎng):無(wú)菌操作下,用取樣器吸取5%柚皮提取物到6個(gè)滅菌平皿中,每種菌做兩個(gè)平行,另取6個(gè)滅菌平皿作空白,倒入已滅菌置45℃下恒溫的PSA培養(yǎng)基約15mL(每次實(shí)驗(yàn)平皿中培養(yǎng)基倒入量應(yīng)保持一致),充分混勻制成平板。用接種針把少量的三種霉菌接種在平板表面上,成等邊3角形的3點(diǎn)接種,在溫度28±1℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3d,使各自獨(dú)立形成菌落,分別于第2天和第3天觀察記錄菌落生長(zhǎng)情況,并測(cè)量菌落直徑大小。抑菌率通過(guò)以下公式計(jì)算:抑菌率/%=空白菌落直徑-樣品菌落直徑空白菌落直徑×1002結(jié)果與分析2.1柚皮提取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用2.1.1沙門(mén)氏菌和細(xì)菌mic的mic測(cè)定用稀釋好的0.25%、0.5%、1%、2%、2.5%等5個(gè)濃度的柚皮提取物測(cè)定對(duì)大腸桿菌,沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的MIC,并計(jì)算抑菌率,結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn),柚皮提取物對(duì)大腸桿菌,金葡球菌和沙門(mén)氏菌都具有一定的抑菌作用。對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng),其MIC均為1%,但對(duì)沙門(mén)氏菌的抑制作用較弱,當(dāng)濃度達(dá)到2.5%時(shí),抑制率僅為65.2%。2.1.2spe用量對(duì)菌株抑菌圈的影響用稀釋好的0.5%、1%、2.5%、2.5%和1∶50的葡萄柚原液5種不同濃度的柚皮提取物的抑菌圈直徑大小,比較柚皮提取物的抑菌效果,結(jié)果見(jiàn)表2?？咕匾志υ囼?yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)是:抑菌圈直徑>15mm時(shí)為高度敏感、10~15mm時(shí)為中度敏感,7~9mm時(shí)為低度敏感、無(wú)抑菌圈者為不敏感。從表2可以看出,葡萄柚對(duì)供試3種細(xì)菌均有很強(qiáng)的抑制效果,2%的葡萄柚原液抑菌圈均大于15mm,屬高度敏感,而柚皮提取物對(duì)所試3種細(xì)菌均有一定的抑制效果,當(dāng)提取物濃度為1%時(shí)即有一定的抑菌圈,而且隨著提取物濃度的增加,其抑菌效果也成上升趨勢(shì),當(dāng)濃度達(dá)5%時(shí)均表現(xiàn)為中度敏感,但相比較而言,SPE對(duì)大腸桿菌和金葡球菌的抑制作用強(qiáng)于沙門(mén)氏菌,這與MIC的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但是其量效關(guān)系和MIC實(shí)驗(yàn)相比較,不是很明顯。這可能是與提取物的擴(kuò)散性有關(guān),當(dāng)提取液在濾紙片吸附后,不能很好的擴(kuò)散到培養(yǎng)基中去,影響了抑菌效果。2.1.3ph值對(duì)抑菌效果的影響分別調(diào)節(jié)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基pH值為5、6、7.2,用平板稀釋法測(cè)定1.0%柚皮提取物在不同pH的環(huán)境中對(duì)供試3種細(xì)菌的抑制效果,結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1表明,pH對(duì)柚皮提取物抑菌有較明顯的影響,偏酸性的pH值更有利于抑菌。在pH5~6范圍內(nèi),柚皮提取物抑菌效果更好,這可能是因?yàn)殍制S酮是提取物中起抑菌作用的主要物質(zhì)之一,而柚皮黃酮在酸性條件下比較穩(wěn)定。同時(shí),當(dāng)介質(zhì)pH分別為5和6時(shí),空白對(duì)照中金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的菌落數(shù)也明顯少于pH7.2時(shí),這是因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的最適生長(zhǎng)條件是pH7.0~7.5,在酸性條件下金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌本身的生長(zhǎng)也受到了抑制,而大腸桿菌的最適生長(zhǎng)條件是pH6.0~7.0,在pH5時(shí),其本身的生長(zhǎng)也受到了一定的抑制。2.1.4抑菌效果的測(cè)定分別用不同溫度下處理柚皮提取物,用平板稀釋法測(cè)定不同溫度處理后的1.0%柚皮提取物對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌效果。結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2表明,經(jīng)過(guò)50℃處理,樣品的抑菌活性基本未變,但經(jīng)過(guò)80℃和100℃處理后樣品的抑菌活性已經(jīng)大幅度降低,這可能是經(jīng)過(guò)高溫加熱后,提取物中抑菌物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,從而降低了抑菌效果。2.2柚子皮提取物對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響制備含柚皮提取物的PSA培養(yǎng)基平板,將黑曲霉、青霉和米曲霉3點(diǎn)接種到平板上,培養(yǎng)觀察測(cè)定菌落直徑大小,以初步評(píng)價(jià)柚皮提取物對(duì)霉菌的作用效果,結(jié)果見(jiàn)表6。表3表明,柚皮提取物對(duì)霉菌有一定的抑制作用,對(duì)黑曲霉的抑制作用最明顯,2%的柚皮提取物抑制率為60.5%;對(duì)青霉和米曲霉的抑制作用相對(duì)較弱5%的柚皮提取物對(duì)青霉和米曲霉抑制率分別為59.5%和34.3%。3抑菌活性的測(cè)定Negi等研究發(fā)現(xiàn),葡萄柚的正己烷提取物的醇溶組分有較強(qiáng)的抑菌活性,混合物的抑菌活性強(qiáng)于從中所分離出的純柚皮苷,說(shuō)明是多種組分共同發(fā)揮抑菌作用的。林捷等用不同溶劑提取梁平柚皮并對(duì)提取物抑菌作用進(jìn)行了研究,結(jié)果表明柚皮經(jīng)乙酸乙酯浸提而得的提取物抑菌效果最好,而乙醇、石油醚、丙酮、乙醚浸提的樣品抑菌效果并不理想。且乙酸乙酯提取物對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑制作用很微弱,而對(duì)蘇云金芽孢桿菌,卵黃色八疊球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌具有很強(qiáng)的抑制作用。因此他認(rèn)為,提取