精子體外處理技術(shù)對(duì)供精人工授精妊娠率的影響

精子體外處理技術(shù)對(duì)供精人工授精妊娠率的影響

近20年來(lái)，隨著助產(chǎn)性技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的新技術(shù)和新方法被應(yīng)用于非子女的治療。就男性不育夫婦而言,精子庫(kù)技術(shù)和人工授精仍然是最常用的方法。目前,供精人工授精(AID)的妊娠率不夠理想。本文探討在供精人工授精過(guò)程中精子的體外處理對(duì)妊娠率的影響,以圖提高AID的妊娠率。數(shù)據(jù)和方法一、患者年齡分布情況2003年1月—2005年12月就診于本院的241對(duì)不育夫婦,其中男方無(wú)精子癥228例,嚴(yán)重少弱精子癥13例。女方年齡22~35歲,平均(29.7±3.6)歲,不孕年限2—12年,平均(4.2±2.6)年。所有患者按衛(wèi)生部規(guī)定的AID管理規(guī)定準(zhǔn)入。精液來(lái)源于廣東省人類(lèi)精子庫(kù)。二、方法1.注射hcg后mdd(1)自然周期組:于月經(jīng)周期的第12天開(kāi)始行陰道超聲監(jiān)測(cè);(2)克羅米芬(CC)組:于月經(jīng)第3~5天開(kāi)始,每日服CC50mg,連續(xù)5d,然后行超聲監(jiān)測(cè);(3)促性腺激素組:在月經(jīng)周期的第3~5天開(kāi)始注射人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)每日150IU,連續(xù)5d,然后根據(jù)卵泡發(fā)育調(diào)整劑量直到成熟后停藥。當(dāng)LH峰出現(xiàn)或卵泡直徑平均達(dá)18mm時(shí),注射HCG5000~10000IU,18h或36h后行AID。第1次AID后24h超聲提示尚未排卵,則再次行AID。排卵后予以黃體功能支持治療,每日注射黃體酮20mg,連續(xù)10d。2.fsp的培養(yǎng)ICI精液進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇,IUI精液洗滌采用一步離心法,FSP的精液處理先用一步離心法處理后,再用相應(yīng)的培養(yǎng)液稀釋至3~4ml,放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30~60min。3.液配制、配制和使用采用Tyrode’s、BWW、IVF30、HTF等4種培養(yǎng)液,Tyrode’液按配方自行嚴(yán)格配制,BWW、IVF30來(lái)自Vitrolife公司的系列試劑,為瑞典Vitrolife公司產(chǎn)品;HTF液為Quinn’sAdvantageTMFertilization系列,購(gòu)自協(xié)和醫(yī)藥公司,為美國(guó)Sage公司產(chǎn)品。4.主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備5.精子懸液的使用受者取膀胱截石位,暴露宮頸后,用1ml的注射器與特制的無(wú)損傷導(dǎo)管連接,吸取經(jīng)處理后的精子懸液0.5~1ml,將導(dǎo)管輕輕插入宮頸或?qū)m腔,于2~3min將精子懸液注入后,緩慢取出導(dǎo)管,臀高位仰臥30min。FSP用CCD公司生產(chǎn)的專(zhuān)用FSP導(dǎo)管,具體手術(shù)操作見(jiàn)文獻(xiàn)。三、統(tǒng)計(jì)處理所有數(shù)據(jù)輸入SPSS8.0軟件,采用t檢驗(yàn)和x2檢驗(yàn)。結(jié)果一、精子密度和活動(dòng)率由表1可知,241對(duì)夫婦進(jìn)行的431個(gè)AID治療周期中,冷凍精液經(jīng)復(fù)蘇后和經(jīng)Tyrode’液、BWW處理后精子密度和活動(dòng)率差異無(wú)顯著意義(P>0.05),而經(jīng)IVF30、HTF處理后精子的活動(dòng)率較Tyrode’液、BWW處理后顯著提高(P<0.05)。二、催化期妊娠率210個(gè)自然周期共妊娠15例,周期妊娠率為7.14%。其中用原冷凍精液經(jīng)復(fù)蘇后行宮頸管內(nèi)人工授精(ICI)102周期,周期妊娠率為6.8%(7/102);108例用Tyrode’液、BWW液IVF30液和HTF液處理后行IUI或FSP,HTF組和IVF30組的妊娠率顯著高于Tyrode’液組和BWW組(P<0.05),見(jiàn)表2。三、兩組率比較由表3可知,在超排卵周期中,70例復(fù)蘇精液直接行ICI,妊娠率為7.14%(5/70),顯著低于用培養(yǎng)液處理后行IUI或FSP組(P<0.05)。在4種培養(yǎng)液的比較中,以IVF30液和HTF液行處理精液后的妊娠率最高(P<0.05)。四、妊娠率的比較在431個(gè)AID治療周期中共47例妊娠,周期妊娠率為10.90%。由表4可知,ICI的妊娠率為6.98%(12/172),IUI的妊娠率為13.54%(26/192),FSP的妊娠率為13.43%(9/67)。IUI的妊娠率以IVF30液處理后最高(25.00%),FSP的妊娠率以HTF液處理后最高(23.53%),IVF30組和HTF組行IUI和FSP的妊娠率與復(fù)蘇精液、Tyrode’液和BWW液組相比較差異有顯著性意義(P<0.005)。精子培養(yǎng)液、培養(yǎng)基和給藥方法的選擇人工授精是治療不育癥的有效方法之一。對(duì)患有少精子癥、無(wú)精子癥以及遺傳性疾病的男性,可采用AID的方法達(dá)到妊娠的目的。人工授精的成功率各家報(bào)道不一,這可能是由于在人工授精的原因和適應(yīng)證的選擇、精液質(zhì)量和處理方法以及是否采用促排卵方案等方面不同造成的。國(guó)外資料表明采用促排卵結(jié)合宮腔內(nèi)人工授精(IUI),其周期妊娠率為14.6%~19.7%。總的來(lái)說(shuō),人工授精的妊娠率不夠理想。作為輔助受孕的介質(zhì)培養(yǎng)液是精子在體外孵育、篩選的主要環(huán)境,直接影響到精子處理和人工授精的效果。本研究旨在AID過(guò)程中對(duì)冷凍的精液用不同培養(yǎng)液進(jìn)行體外處理,以探討各種培養(yǎng)液對(duì)處理后精子質(zhì)量的影響,尋求實(shí)用、簡(jiǎn)便有效的培養(yǎng)介質(zhì),改善和提高人工授精的妊娠率。精子體外處理的目的是去除雜質(zhì)和精漿,增加運(yùn)動(dòng)精子密度,提高精子質(zhì)量,使精子獲能,以提高人工授精的成功率,在不育癥的治療上有著積極的作用。培養(yǎng)液作為精子體外處理的常用介質(zhì),是為了創(chuàng)造盡可能與體內(nèi)自然條件相似的人工環(huán)境,保證上述目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。目前常用的培養(yǎng)液種類(lèi)很多,比較常用的有Tyrode’s、BWW、IVF30、HTF液等。各種細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分基本相同,都含有細(xì)胞存活所必需的各種氨基酸、離子等。并且精子培養(yǎng)液含有多種無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖類(lèi)物質(zhì),為精子提供穩(wěn)定有利的離子環(huán)境和能量來(lái)源蛋白、乳酸和酸堿度。在人工授精中,更替精子培養(yǎng)液是用來(lái)提高妊娠率的一個(gè)方面。精子由于缺乏核糖體、核仁、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體等細(xì)胞器,細(xì)胞產(chǎn)生能量的主要代謝方式是三羧酸循環(huán),三羧酸循環(huán)以丙酮酸與草酰乙酸為起始物,而丙酮酸是以葡萄糖為反應(yīng)物在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過(guò)糖酵解產(chǎn)生的。精子作為體內(nèi)唯一能夠快速運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞,對(duì)能量供應(yīng)需求很大。如果在精子培養(yǎng)液中補(bǔ)充丙酮酸鈉等直接參與三羧酸循環(huán)的物質(zhì),跨過(guò)從葡萄糖到丙酮酸的代謝步驟,則較有利于精子的能量代謝。另外,各種培養(yǎng)基中某些成分的增減也有提高妊娠率的作用,如培養(yǎng)液中增加K+和Mn2+,同時(shí)相應(yīng)的降低Na+濃度,便能使妊娠率提高2倍多。在本研究所用的四種培養(yǎng)液中,IVF30和HTF都是由原始輸卵管液的配方改良而來(lái),成分中除含有Tyrode’s和BWW中基本的電解質(zhì)、葡萄糖外,IVF30為改良加入含蛋白的培養(yǎng)基,而第三代的HTF培養(yǎng)基則在第2代HTF的基礎(chǔ)上,有選擇地加入非必需氨基酸、?；撬帷DTA和檸檬酸。培養(yǎng)基中的鎂鹽、葡萄糖、丙酮酸鈉和乳酸的水平調(diào)整到反映正常生理發(fā)育的最佳水平。可增強(qiáng)精子的能量代謝,更有利于提高精子的活動(dòng)能力和授精能力,是目前公認(rèn)對(duì)配子培養(yǎng)和體外授精最佳的培養(yǎng)基。在本研究中,采用一步離心法處理供精的冷凍精液。一般認(rèn)為,離心會(huì)引起不同程度的精子損傷。但國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)離心后精子活動(dòng)率和宮頸粘液穿透力并不低于復(fù)溫后未經(jīng)離心直接觀察的凍融組精子,說(shuō)明低速離心處理(1790g/min)不僅可以提高精子密度、減少體外處理過(guò)程中精子的丟失,而且也不會(huì)對(duì)復(fù)溫后精子的前述功能產(chǎn)生不利作用。本研究也發(fā)現(xiàn)用不同的培養(yǎng)液經(jīng)一步離心法處理后,精子的密度無(wú)顯著差異,而精子的活動(dòng)率卻以IVF30和HTF較高(P<0.05);在妊娠結(jié)局方面,IUI的妊娠率以IVF30液處理后最高(25.00%),與其他組織相比差異有顯著性意義(P<0.05);FSP的妊娠率以HTF液處理后高(23.53%),與其他組織相比差異有顯著性意義(P<0.005)。目前,人工授精手術(shù)方法有宮頸管內(nèi)授精(ICI)、子宮腔內(nèi)授精(IUI)、直接腹腔內(nèi)授精、直接卵泡內(nèi)授精和經(jīng)陰道輸卵管內(nèi)授精等。近年來(lái),探索簡(jiǎn)單易行的人工授精新方法,成為助孕技術(shù)中的一個(gè)重要的研究方向。本研究表明,在選擇IUI時(shí),以IVF30培養(yǎng)液處理精液的妊娠率最高;而選擇FSP時(shí),卻以HTF處理精液的妊娠率最高。相對(duì)3種手術(shù)方式而言,在理論上FSP直接將高活力活化的精子懸液注入輸卵管,可以保證有較多的活動(dòng)精子直接進(jìn)入生理受精部位,同時(shí)避免了精子同宮頸粘液與子宮內(nèi)膜面的接觸,可能是這種方法具有一定療效的原因,但對(duì)于FSP的妊娠率,國(guó)外資料表明還存在著較大的差異。本研究也表明,在不同的培養(yǎng)液和手術(shù)方式的比較中,以IVF30液處理精液后行IUI和HTF液處理精液后行FSP的妊娠率最高(分別為25.00%和23.53%),顯著高于Tyrode’液和BWW液處理的妊娠率,差異有顯著性意義(P<0.05)。在相同條件下,用Tyrode’液和BWW液處理的精液卻無(wú)法達(dá)到同等效果,可能這是對(duì)FSP妊娠率各家報(bào)道差異較大的原因之一。在哺乳動(dòng)物,輸卵管為配子輸送、儲(chǔ)存、受精及早期胚胎發(fā)育提供了微環(huán)境。研究輸卵管對(duì)精子影響,對(duì)于理解受精及體內(nèi)微環(huán)境對(duì)受精的影響具有一定的理論意義。以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),輸卵管細(xì)胞能延長(zhǎng)精子的存活時(shí)間,輸卵管細(xì)胞通過(guò)分泌輸卵管素(oviductin)作用于精子,延長(zhǎng)精子存活時(shí)間,這一作用呈劑量依賴(lài)性。FSP由于直接將活化的精子懸液注入輸卵管,省略了精子獲能及通過(guò)宮腔等正常的生理過(guò)程,因而在行FSP時(shí)應(yīng)考慮到輸卵管局部微環(huán)境對(duì)精子生理功能的影響。故在選擇不同的手術(shù)方式時(shí),應(yīng)考慮到不同的精液處理方法和精子直接到達(dá)的體內(nèi)不同環(huán)境對(duì)精子活動(dòng)能力和受精潛能的影響。選擇越接近