adfcofilin家族的生物信息學(xué)分析

adfcofilin家族的生物信息學(xué)分析

細(xì)胞骨架中的肌動(dòng)蛋白參與了許多重要的生理活動(dòng)，如肌肉收縮、細(xì)胞環(huán)流、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分離等。這些過程的發(fā)生除了需要肌動(dòng)蛋白以外,還需要一些與之結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白參與,現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白,其中有一類分子量為15-20KD的蛋白,如肌動(dòng)蛋白解聚因子(actindepolymerizingfactor,ADF)、cofilin、profilin、actophorin、depactin、destrin、UNC-60等,在一定條件下可以使肌動(dòng)蛋白微絲解聚,統(tǒng)稱為ADF/cofilin分子家族。一、adf在生物細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)不同組織分布及分布特點(diǎn)ADF/cofilin分子家族在哺乳類、鳥類、兩棲類、昆蟲、棘皮動(dòng)物、原生動(dòng)物和植物等生物的細(xì)胞內(nèi)廣泛存在,其中cofilin廣泛分布于從酵母到哺乳類的生物體內(nèi),而destrin主要集中分布在鳥類和哺乳類的個(gè)體中。ADF/cofilin分子家族的存在是與其功能密切相關(guān)的,每一種分子根據(jù)其功能的需要,在個(gè)體的不同組織、細(xì)胞以及細(xì)胞內(nèi)部不同部位的分布都有一定程度的差異。ADF位于許多脊椎動(dòng)物組織中,在神經(jīng)元細(xì)胞中尤為豐富。在百合和油菜的花絲中檢測(cè)到特異表達(dá)的ADF(分別稱為L(zhǎng)MP131A和BMP1),而在花瓣、心皮、花芽、葉片和根中則檢測(cè)不到。變形蟲中的actophorin與肌動(dòng)蛋白一起主要分布于胞質(zhì)皮層中,特別是在運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的前緣。ADF/cofilin分子家族在生物個(gè)體的不同發(fā)育階段,其分布和含量也有一定的差異。鳥類的ADF,亦存在于雞胚和絕大多數(shù)成熟組織中,占總蛋白的0.1%-0.4%,而成熟心臟和骨骼肌中含量不到0.02%,當(dāng)受精卵發(fā)育到11天時(shí),骨骼肌中ADF的量達(dá)到最大值,孵出14天后降低到成年水平。玉米中的ADF分子ZmABP1和ZmABP2在花粉粒和萌發(fā)的花粉管中特異表達(dá),而ZmABP3在這個(gè)時(shí)期檢測(cè)不到,可能在這一特定的發(fā)育階段,ZmABP1和ZmABP2受到某種信號(hào)的調(diào)節(jié)而表達(dá)。但在大鼠小腦的整個(gè)發(fā)育過程中,ADF的量始終保持恒定,且主要位于Purkinje細(xì)胞中。二、adfcofili分子家族對(duì)肌肉和蛋白巖的影響1.adf與g-actin的結(jié)合ADF/cofilin分子家族在一定條件下可以與G-actin、F-actin相結(jié)合,形成1:1的ADF-actin復(fù)合物,但對(duì)結(jié)合了ATP、ADP、AMPPNP等核苷酸的G-actin和F-actin的親和力不同。其中人的ADF與G-actin結(jié)合形成的復(fù)合物的解離常數(shù)為0.2μmol/L,源于雞胚腦細(xì)胞中的ADF在體外與G-actin-ATP和G-actinAMPPNP結(jié)合形成的復(fù)合物的解離常數(shù)是0.1-0.2μmol/L,而與G-actin-ADP結(jié)合形成的復(fù)合物的解離常數(shù)為1.3μmol/L。在生理離子條件和pH7.8時(shí),擬南芥ADF1結(jié)合G-actin-ADP或F-actin的量是ATP或ADP-Pi結(jié)合形式的兩倍,表明ADF能夠優(yōu)先與actinADP相結(jié)合。變形蟲的actophorin與變形蟲和兔骨骼肌的G-actin的親和力相同,但對(duì)兔F-actin的親和力是對(duì)變形蟲F-actin的親和力的10倍。1997年Jiang等用玉米ZmADF3的兩個(gè)突變體進(jìn)行實(shí)驗(yàn),ZmADF3-1為分別用Phe和Gly替換ADF3中Tyr103和Ala104的突變體,結(jié)果與G-actin和F-actin的結(jié)合能力均減弱;ZmADF3-2為用Phe替換ADF3中Tyr67和Tyr70的突變體,結(jié)果對(duì)G-actin的親和力與ADF3相似,但不與F-actin相結(jié)合,表明ADF與G-actin和F-actin的結(jié)合部位不同。在一定條件下,ADF/cofilin可以促使肌動(dòng)蛋白微絲解聚。例如人的ADF、鳥的ADF、cofilin、豬的destrin、變形蟲的actophorin以及棘皮動(dòng)物的depactin等在較高的pH值條件下,都可以促使微絲解聚。但是,不同來源的ADF/cofilin和肌動(dòng)蛋白之間的作用也不相同。如盡管秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegan)的肌動(dòng)蛋白和兔骨骼肌的肌動(dòng)蛋白的生化特性相同,UNC-60對(duì)C.elegan的微絲具有明顯的解聚活性,而對(duì)兔骨骼肌的微絲無明顯作用有人認(rèn)為ADF/cofilin是通過隔離肌動(dòng)蛋白單體促使微絲解聚的,Charlier等則認(rèn)為是通過改變G-actin的臨界濃度來實(shí)現(xiàn)的,而McGough等的研究證明cofilin可能是通過增加微絲之間的扭曲程度,從而促使微絲解聚的,這方面的機(jī)理還有待進(jìn)一步的深入探討。另外值得一提的是,ADF/cofilin不只具有結(jié)合肌動(dòng)蛋白和解聚微絲的活性,改變條件,它們也能促使微絲聚合。2.adf信號(hào)分子調(diào)節(jié)細(xì)胞磷酸化ADF/cofilin對(duì)肌動(dòng)蛋白的作用是受多方面因素影響的,但通常它們都受pH的調(diào)節(jié)。人的ADF在pH<7.0時(shí),與F-actin結(jié)合,在pH>7.5時(shí),僅與G-actin結(jié)合。雞的ADF在pH6.5-7.1時(shí)與F-actin共沉淀,僅有微弱的解聚活性;在pH7.1-7.9時(shí)解聚活性增強(qiáng),而結(jié)合F-actin的活性減弱;在pH8.0時(shí)以化學(xué)計(jì)量的方式解聚微絲,形成1:1的ADF-G-actin復(fù)合物,此時(shí)ADF也可以隔離G-actin,阻止肌動(dòng)蛋白的聚合。pH對(duì)該類分子的影響表現(xiàn)為低pH值時(shí)與F-actin結(jié)合,pH值升高,解聚活性增強(qiáng),與F-actin的結(jié)合能力減弱,而與G-actin的結(jié)合能力增強(qiáng)。但變形蟲的actophorin對(duì)肌動(dòng)蛋白的作用卻不受pH值的影響,它在各種pH條件下與雞的ADF在pH6.5時(shí)結(jié)合F-actin的形式相似。ADF/cofilin的活性還受細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)分子以及自身磷酸化的調(diào)節(jié)。ADF有兩種形式,磷酸化的ADF(pADF)不結(jié)合G-actin,也不使微絲解聚,在體外用堿性磷酸酶去除磷酸基團(tuán)可以恢復(fù)它的解聚活性。在HeLa細(xì)胞中導(dǎo)入ADF的突變體cDNA,使Thr25、Ser24突變或被替換,ADF表達(dá)且能被磷酸化;而Ser3被剔除或是被Ala或Glu替換,ADF表達(dá)但不能被磷酸化,表明Ser3(成熟肽的Ser2)為HeLa細(xì)胞的ADF分子中唯一的磷酸化位點(diǎn)。Smertonko等用同樣的方法證明Ser6為玉米中ZmADF唯一的磷酸化位點(diǎn)。Morgan等在體外實(shí)驗(yàn)中,用任選的4種蛋白激酶一依賴于Ca2+/CaM的蛋白激酶Ⅱ(CaMkinaseⅡ)、蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)和肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)—對(duì)源于雞胚腦的ADF進(jìn)行磷酸化實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)CaMkinaseⅡ具有微弱的磷酸化活性,而PKA、PKC和MLCK都不能使ADF磷酸化,推測(cè)體內(nèi)有更加特異的蛋白激酶的作用。在HT4和皮層神經(jīng)元細(xì)胞中Ca2+濃度和cAMP濃度的升高可以使pADF快速去磷酸化,Ca2+是通過激活蛋白磷脂酶2B(PP2B)使pADF去磷酸化的;cAMP則通過激活蛋白磷脂酶1(PP1)來實(shí)現(xiàn)。用cAMP處理培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,15分鐘后引起肌動(dòng)蛋白骨架的破裂。表皮生長(zhǎng)因子(NGF)、胰島素、促腎上腺素(TSH)等也能導(dǎo)致pADF的快速去磷酸化,生長(zhǎng)因子對(duì)ADF/cofilin分子具有磷酸化和去磷酸化的雙重作用。10%的DMSO、dBcAMP、ML-9等處理也可以降低ADF的磷酸化水平,引起微絲的重排。所有這些因子可能都是通過細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)途徑,即信號(hào)分子通過細(xì)胞內(nèi)部的第二信使,調(diào)節(jié)蛋白激酶/磷脂酶的活性,使ADF磷酸化或pADF去磷酸化,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架的精細(xì)調(diào)節(jié)。一些位于較高等生物體內(nèi)的ADF/cofilin分子,如脊椎動(dòng)物的ADF、cofilin、destrin、玉米的ADF3、棘皮動(dòng)物的depactin等,含有類似SV-40大T抗原的兼性結(jié)構(gòu)(KKRKK),在受到細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)刺激時(shí),可以與肌動(dòng)蛋白一起從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中。用熱激或DMSO處理培養(yǎng)的細(xì)胞,ADF和coilin便與肌動(dòng)蛋白一起從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核中,形成棒狀結(jié)構(gòu)。熱激和DMSO處理可能觸發(fā)了ADF與肌動(dòng)蛋白的反應(yīng),肌球蛋白可能也參與這一過程。由于熱激或DMSO處理能夠引起動(dòng)植物細(xì)胞的凋亡,推測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ADF/cofilin分子家族也參與了細(xì)胞的凋亡過程。而在一些較低等生物的ADF/cofilin分子中,如變形蟲的actophorin、弓形蟲的ADF等,卻不具有這一核定位結(jié)構(gòu)。3.profiren和adf的作用ADF/cofilin分子對(duì)肌動(dòng)蛋白的作用還表現(xiàn)為一定的協(xié)同性。如脊椎動(dòng)物的ADF和變形蟲的actophorin能夠協(xié)同結(jié)合F-actin。實(shí)驗(yàn)證明,profilin與ADF協(xié)同作用可以促使微絲踏車(treadmilling)的速度比在純肌動(dòng)蛋白溶液中高125倍,profilin和ADF可能是在微絲纖絲的兩端以互補(bǔ)的方式促進(jìn)這一踏車過程的。在pH6.0-8.0時(shí),UNC-60A可以解聚微絲,但不再與F-actin結(jié)合;而UNC-60B可以結(jié)合F-actin,但卻不能使微絲解聚,表現(xiàn)為相互補(bǔ)充的效應(yīng)。但是,變形蟲中的actophorin與來源于兔骨骼肌的F-actin之間結(jié)合表現(xiàn)為協(xié)同性,而與自身來源的F-actin之間的結(jié)合和分離表現(xiàn)為簡(jiǎn)單的雙分子反應(yīng)。此外,ADF/cofilin分子家族對(duì)肌動(dòng)蛋白的作用也可以被另外一些肌動(dòng)蛋白的結(jié)合蛋白所調(diào)節(jié),如原肌球蛋白結(jié)合F-actin以后可以防止微絲被ADF解聚;在25℃時(shí),以8.4/1.0的摩爾比結(jié)合形成的肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白復(fù)合物,可以保護(hù)58%的微絲在3小時(shí)內(nèi)不被過量的ADF解聚。這將有利于有機(jī)體細(xì)胞在一定條件下,保持相對(duì)的平衡和穩(wěn)定。三、adf與cofirenc分子的組成及序列分析ADF/cofilin家族的各個(gè)分子的大小和氨基酸序列雖然不盡相同,但卻具有很大程度的相似性。人類ADF分子的cDNA有1452bp,編碼的ADF分子具有165個(gè)氨基酸殘基,分子量為19KD,該分子100%同源于豬的destrin,95%同源于雞的ADF,70%同源于豬和鼠的cofilin,但與actophorin僅有28%的序列相似。雞胚ADF具有165個(gè)氨基酸殘基,70%同源于雞和哺乳類的cofilin;雞胚cofilin具有166個(gè)氨基酸殘基,80%同源于豬腦的cofilin。蟾蜍的ADF具有168個(gè)氨基酸殘基,分別與雞的ADF和cofilin有66%、77%的序列同源性。玉米中的ZmABP3分子量為17KD,與ZmABP1和ZmABP2分別有56%和58%的同源性。而弓形蟲的ADF僅有118個(gè)氨基酸殘基,分子量為13.4KD,僅由單一拷貝基因編碼。在ADF/cofilin分子家族的N端和C端具有與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的部位。在N端,人ADF、雞ADF、豬destrin中為M1A2S3G4V5Q6V7A8D9,在雞cofilin中為M1A2S3G4V5T6V7N8D9,酵母的cofilin為M1S2R3S1G5V6A7V8A9D10;在C端,人ADF和豬destrin為W104A105P106E107L108A109P110L111K112S113K114M115,酵母的cofilin為W104S105P106D107T108A109P110V111R112S113K114M115,棘皮動(dòng)物的depactin為W104S105M106E107T108A109N110I111K112L113K114M115。Yonezawa等用模擬cofilinC端結(jié)合肌動(dòng)蛋白位點(diǎn)的人工合成十二肽實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)它可以抑制肌動(dòng)蛋白與cofilin的結(jié)合,進(jìn)一步證明這一序列為ADF/cofilin與肌動(dòng)蛋白結(jié)合和促使微絲解聚的必需序列?？梢钥闯鰺o論是與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合部位還是分子的全序列,都是高度保守的,這種保守性表現(xiàn)為物種間的親緣關(guān)系越近,分子間的相似程度越高。正是這種結(jié)構(gòu)上的保守性,保證ADF分子對(duì)肌動(dòng)蛋白的調(diào)節(jié)功能。四、adf/cofili分子家族對(duì)肌動(dòng)蛋白的作用由于肌動(dòng)蛋白骨架參與了細(xì)胞內(nèi)一系列的生理活動(dòng),而ADF/cofilin分子家族可以直接作用于肌動(dòng)蛋白,必然對(duì)這些生理活動(dòng)也有重要影響。1.肌動(dòng)蛋白網(wǎng)的形成和擴(kuò)大細(xì)胞移動(dòng)的速度粘菌中cofilin過量表達(dá)至正常細(xì)胞水平的兩倍,在細(xì)胞內(nèi)形成肌動(dòng)蛋白網(wǎng),細(xì)胞皺褶明顯,細(xì)胞移動(dòng)的速度也相應(yīng)增加兩倍。這與離體條件下,在稀釋的血小板抽提物中加入過量的ADF1后,引起微絲踏車速度加快的結(jié)果相似。2.胞質(zhì)的改變和網(wǎng)的橫向流動(dòng)將在細(xì)菌中表達(dá)重組的玉米ZmADF1注入鴨跖草雄蕊毛細(xì)胞中,起初細(xì)胞內(nèi)所有的胞質(zhì)環(huán)流均停止,中心橫越液泡的微絲束被破壞,20-45分鐘后,環(huán)流恢復(fù),但在胞質(zhì)皮層中呈明顯的橫向流動(dòng),用熒光標(biāo)記的羅丹明檢測(cè),發(fā)現(xiàn)縱向的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)已被橫向的射線所替代,這與新的環(huán)流方式相一致。3.filiin—神經(jīng)元的生長(zhǎng)將35S標(biāo)記的Met注入雞腰椎脊髓的坐骨神經(jīng)中,間隔20天檢測(cè),發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白與其結(jié)合蛋白ADF、cofilin、profilin—起沿著軸突轉(zhuǎn)移,且轉(zhuǎn)移的速度相同,其方式可能是ADF、cofilin、profilin與肌動(dòng)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物一起緩慢移動(dòng)。在這個(gè)過程中,ADF和pADF的活性沒有明顯的變化,可能在整個(gè)過程中,失活與再激活的ADF連續(xù)存在,以促使G-actin與F-actin的交換。4.基因zmabp1和zmabp2表達(dá)在花粉進(jìn)入休眠和花粉管萌發(fā)的激活過程中,均需要肌動(dòng)蛋白骨架的重排。玉米基因ZmABP1和ZmABP2在花粉粒及萌發(fā)的花粉管中特異表達(dá),但是ZmABP3在這個(gè)時(shí)期檢測(cè)不到,可能在這一特定的發(fā)育階段,ZmABP1和ZmABP2受到特定信號(hào)的刺激而表達(dá),并進(jìn)一步參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的重排過程。5.xenopusadf/cofiren抗體對(duì)體外生長(zhǎng)的影響cofilin位于許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞和早期爪蟾胚的卵裂溝中。無論抑制肌動(dòng)蛋白聚合或是抑制肌動(dòng)蛋白解聚的試劑均可阻斷胞質(zhì)分裂。在爪蟾二細(xì)胞胚階段,在其中一個(gè)細(xì)胞中注入XAC(XenopusADF/cofilin)抗體,可以抑制XAC的活性,該細(xì)胞