地高辛標(biāo)記探針的Southern-雜交技術(shù)

地高辛標(biāo)記探針的Southern雜交技術(shù)根據(jù)核酸變性與復(fù)性的特性，特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA能夠在一定條件下與具有互補(bǔ)性的核酸鏈退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)，稱之為核酸雜交。將已知的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA進(jìn)行標(biāo)記，制成核酸探針，就可以用它檢測(cè)樣品中是否存在同源序列，或確定不同物種之間的親緣關(guān)系，已成為分子生物學(xué)中一類重要的檢測(cè)手段，在科學(xué)研究和實(shí)踐中具有十分廣泛的用途。它可用于基因組特定DNA序列的定位，測(cè)定相關(guān)片段的同源性、從cDNA文庫(kù)、基因組文庫(kù)中篩選完整基因等。還可以用于構(gòu)建DNA分子的酶切圖譜和遺傳圖—指紋分析等。核酸雜交檢測(cè)都是在濾膜上進(jìn)行的，常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜等。其基本過(guò)程包括以下幾步。首先將待檢樣品DNA或RNA分子直接點(diǎn)加到濾膜上，或經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離再通過(guò)毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地“吸印”上去的，這個(gè)過(guò)程稱為核酸印跡（nucleicacidblotting）轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法（dotandslotblotting）、菌落和嗜菌斑印跡法（colonyandplaqueblotting）；然后將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。最后，經(jīng)過(guò)放射自顯影技術(shù)或光化學(xué)、免疫學(xué)技術(shù)顯示出不同的顏色，根據(jù)顏色的有無(wú)和深淺判定結(jié)果。根據(jù)操作方式和檢測(cè)對(duì)象的不同，核酸雜交技術(shù)主要有以下幾種：斑點(diǎn)雜交技術(shù)（Dotblot）、Southern雜交技術(shù)（Southernblot）、Northern雜交技術(shù)（Northernblot）。前兩者用于檢測(cè)DNA，后者用于檢測(cè)RNA。本實(shí)驗(yàn)主要介紹Southern雜交技術(shù)。1主要內(nèi)容1.SouthernBlot方法的原理。2.DNA瓊脂糖凝膠電泳。3.DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜/尼龍膜及膜處理。4.介紹隨機(jī)引物法標(biāo)記DNA探針，Southernblot的預(yù)雜交、雜交及顯色過(guò)程。2目的要求掌握Southernblot方法的原理；掌握隨機(jī)引物法標(biāo)記DNA探針，印跡法轉(zhuǎn)移DNA至硝酸纖維素膜及膜處理。3實(shí)驗(yàn)原理Southern雜交技術(shù)是由EdwardM.Southern在1975年首先發(fā)明的用于檢測(cè)DNA的一種核酸雜交技術(shù)，并因此而得名。Southern雜交的原理是將待檢測(cè)的DNA分子用限制性內(nèi)切酶消化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按照其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其他標(biāo)記物標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待測(cè)物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)原理進(jìn)行結(jié)合，游離的探針洗滌后用顯影或其他合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個(gè)主要過(guò)程：一是將待測(cè)定核酸分子通過(guò)一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，即印跡（blotting）；二是固定于膜上的核酸與同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過(guò)程。見(jiàn)圖1。圖1.Southernblot印跡雜交原理示意圖（a）核酸內(nèi)切酶消化的基因組DNA；（b）瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段；（c）凝膠中的DNA譜帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上；（d）濾膜與標(biāo)記的DNA分子探針雜交；（e）顯色顯示雜交的DNA譜帶。Southernblot方法十分靈敏，在理想的條件下，用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即便每條電泳帶僅含2ngDNA也能被清晰地檢測(cè)出來(lái)。實(shí)驗(yàn)儀器：尼龍膜；恒溫水浴，塑料帶，剪刀，平頭鑷子，封口機(jī)，烤箱，臺(tái)式高速離心機(jī)，高壓滅菌鍋，電泳儀，水平電泳槽，微量移液器，搖床，吸水紙，3MMWhatman濾紙，干烤皿，玻璃平臺(tái)等。溶液配制1．待檢基因組DNA、DIG標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶等。2．其他試劑20XSSC(1000mL):凝膠稍大，形成一個(gè)“橋”，凝膠反放在浸濕的whatman3mm濾紙上注意兩者之間不能有氣泡。(4)照凝膠的大小剪一張硝酸纖維素濾膜/尼龍膜（長(zhǎng)，寬略大0.2cm，剪去與凝膠對(duì)應(yīng)的一角）。膜放在凝膠上。(5)尼龍膜上放一張whatman3mm濾紙（長(zhǎng)，寬略小0.2cm）一疊吸水紙、上置一玻璃板，其上放一重約0.2～0.5kg的物品。在20×SCC的轉(zhuǎn)移緩沖液中充分轉(zhuǎn)移18～24h及時(shí)換掉浸濕的吸水紙。(6)固定：將膜在2×SSC溶液中短暫漂洗，除去過(guò)多的鹽分，然后DNA結(jié)合面朝上，放在一張干凈的濾紙上晾干后，夾在兩層濾紙中間，120oC烘箱中30min，或者80oC2h，促進(jìn)DNA與硝酸纖維素濾膜/尼龍膜結(jié)合。六、預(yù)雜交與雜交(1)預(yù)雜交DiGEasyHyb：將64ml無(wú)菌去離子水分兩部分倒入試劑7#瓶，37oC搖動(dòng)溶解5min，預(yù)熱一定體積的DiGEasyHyb（10ml/100cm2膜）至雜交溫度42oC。預(yù)雜交60min，在不加探針的情況下，僅將膜放在雜交液中42oC下充分潤(rùn)濕。（此過(guò)程可以延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)）(2)探針變性：Dig標(biāo)記的探針1ul（約25ng/ml）加40μlH2O,95oC變性10min后迅速放在冰上冷卻10min。(3)雜交：將變性的探針加入預(yù)熱的DIGEasyHyb（3.5ml/100cm2）中，混勻，避免泡沫，倒出預(yù)雜交液，加入探針和DIGEasyHyb混合液，繼續(xù)在42oC下溫浴過(guò)夜（單拷貝探針）。含有探針的DiGEasyHyb雜交液可重復(fù)利用，雜交結(jié)束后放入離心管中于-20oC保存，可重復(fù)使用幾次，只需在使用前于68oC處理10min即可,不要煮沸DiGEasyHyb雜交液七、洗膜與顯色(1)洗膜：2×SSC，0.1%SDS室溫下洗滌5分鐘，洗2次。0.5×SSC，0.1%SDS65-68oC溫和振蕩15分鐘，洗2次(2)免疫與顯色：a.雜交和洗膜后，用馬來(lái)酸緩沖液（WashingBuffer，Buffer1）浸泡1-5minb.在100ml1×Blocksolution（Buffer2）中溫育30minc.用1×Blocksolution（Buffer2）稀釋抗體–DIG-抗原偶聯(lián)物至150mU/ml（1:5000）d.用10mlantibodysolution處理膜30mine.用100ml馬來(lái)酸洗膜15min，洗2次f.在20mldetectionbuffer（Buffer3）中平衡2-5ming.在8ml新鮮配制的colorsubstratesolution中處理膜5分鐘，放在塑料袋或盒中，保持黑暗中。注意不要在顯色過(guò)程中搖動(dòng)(顏色沉淀在幾分鐘內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)，在16h內(nèi)完成顯色反應(yīng)(在顯色過(guò)程中膜可在光亮處短暫暴露幾次)。h.5h后斑點(diǎn)出現(xiàn)，可在20ml水中洗膜5min中止反應(yīng)。i.結(jié)果照像