風洞實驗在昆蟲行為檢測中的應用

風洞實驗在昆蟲行為檢測中的應用

1實驗方法和工具風景測量技術(shù)是化學生態(tài)學的常用方法。觀察飛昆蟲室內(nèi)行為的反應。這是信息素、植物提取物和其他活性成分及其來源在田間使用之前的有效方法。風洞的大小、形狀有許多種,最常見的是水平風洞。風洞一般包括3個部分:鼓氣裝置;觀察昆蟲行為的工作區(qū);排氣裝置(Howseetal.,1998)?？梢詫z像鏡頭安裝在風洞的側(cè)面、頂端,與計算機相連,在實驗時自動記錄昆蟲的行為和三維飛行軌跡(WitzgallandArn,1991),以方便實驗后做進一步分析?？稍陲L洞底部用傳送帶使一些圖案運動,為昆蟲提供視覺參考,也可以用不同大小、不同顏色的圓形紙片擺放在風洞底部,也能達到同樣的效果。風洞可以非常方便地測定信息化學物質(zhì)的活性,因為昆蟲飛向氣味源的軌跡、用時、降落點等,都是非常直觀的。目前風洞可以應用到下列方面:(1)推測有效行為化合物組分及比例;(2)測定次生代謝物質(zhì)的行為功能;(3)輔助誘芯的改進和誘捕器的設(shè)計;(4)研究昆蟲的定向及化學感受機制;(5)研究殺蟲劑的噴霧過程對昆蟲行為的影響等(周弘春和杜家緯,2001)。2試驗開口的過程2.1光照的控制正式實驗開始前,要做好充分的準備工作,才可能取得理想的測試效果:(1)將照明設(shè)置到實驗的狀態(tài)。進行蛾類昆蟲的實驗時,在測試時間和昆蟲飼養(yǎng)的暗期相一致的情況下,光照通常只有零點幾到幾個勒克斯;(2)通過前期觀察和預實驗,在昆蟲對信息素或植物揮發(fā)性物質(zhì)反應最靈敏的時間進行測試;(3)待測昆蟲要在測試前0.5~1h之前轉(zhuǎn)移到風洞所在的房間,使之適應測試環(huán)境,否則會影響實驗效果;最好將待測昆蟲放入玻璃管內(nèi),兩端用脫脂棉塞住;(4)秒表、記錄紙、鉛筆等也要事先放在方便取用的位置;(5)如果使用攝像機和計算機,要提前開機,使之處于隨時記錄的狀態(tài);(6)保持風洞房間內(nèi)溫度、濕度、光照等條件的穩(wěn)定;(7)整個實驗環(huán)境要保持安靜,避免人為干擾。2.2實驗操作2.1.1飛、定向、麻黃、定位而昆蟲對植物源氣味的定向行為反應則不同,一般只表現(xiàn)出起飛、定向、逆風飛行和降落到誘源等行為。與取食或產(chǎn)卵有關(guān)的行為,昆蟲可以表現(xiàn)出伸喙、取食或腹部卷曲、伸出產(chǎn)卵器刺探等行為(Mechaberetal.,2002)。3風分析的例子3.1繁殖前后其它成分對性吸引的作用蘋果蠹蛾的性信息素的主成分是E8,E10-12OH,即蠹蛾醇(Codlemone)。但在實驗中發(fā)現(xiàn),腺體抽提物比蠹蛾醇更能吸引雄蛾,推測還有其它成分在性吸引中起作用。本實驗主要為了研究蘋果蠹蛾是利用多成分信息素還是單成分信息素(EL-Sayedetal.,1999)。2單頭昆蟲的選擇性測試燈滅后1h開始實驗,持續(xù)3~4h。測試開始15min前,將2日齡雄蛾單獨放入玻璃管(15cm×2.5cm)內(nèi),兩端用紗布封口。單頭昆蟲在風洞的下風口釋放,允許有2min的反應時間。對于單信息素氣味,每天測試15頭雄蟲,連續(xù)測試4d,共實驗60頭昆蟲;選擇性測試中,分別比較雄蛾對求偶雌蛾、腺體抽提物和合成信息素的反應。兩種氣味源擺放在上風口,距離11cm。試蟲釋放位置距氣味源約2m。每次測試重復4次,每次使用20~30頭雄蟲,使得15頭雄蟲降落在氣味源之一上。兩個氣味源在測試重復時更換位置。3雄蛛地位分析結(jié)果表明,求偶雌蟲和腺體抽提物均比合成信息素更能吸引雄蟲;在選擇性測試中,雄蛾降落在求偶雌蟲和腺體抽提物上的個體比例顯著比降落在合成信息素上的高(圖1)。說明除蠹蛾醇外,其它的成分也在性吸引中起作用。3.2類化合物的合成寄主植物釋放的揮發(fā)性氣味物質(zhì)吸引雌蟲前來產(chǎn)卵。識別這些揮發(fā)物的組分對于正確理解昆蟲與植物的相互關(guān)系以及指導植物抗蟲育種都是至關(guān)重要的。研究發(fā)現(xiàn)來自葡萄的3種萜類化合物如(E)-?-石竹烯,(E)-?-金合歡烯和DMNT能引起葡萄藤蛾的產(chǎn)卵反應(Tasinetal.,2006)。這些化合物在植物界中普遍存在,但為什么會引起該蟲的產(chǎn)卵行為呢?2語言風格源的選擇在經(jīng)活性炭過濾的空氣流速為25cm/s,光照10lx,溫度(23±2)℃,相對濕度40%~60%的風洞(63cm×90cm×200cm)中進行。葡萄串(100~150g,直徑5~10mm)放在圓柱形的玻璃容器內(nèi),頂端用棉紗封口。葡萄頂空收集物及合成的化合物通過電子噴霧器釋放,優(yōu)點是保證植物揮發(fā)物以精確的數(shù)量和不變的速度釋放。以上3種氣味源均放在風洞的上風口。將單頭交配過的葡萄藤雌蛾于風洞的下風口處釋放。10頭雌蟲為一批,連續(xù)進行4d。對逆風上行至少60cm的雌蟲歸為“逆風飛行組(Flyingupwind)”;對逆風上行180cm以上降落在氣味源位置的歸為“降落組(Landing)”。分別加以計數(shù)統(tǒng)計。3頂空收集物與葡萄改代劑的配比風洞結(jié)果表明,交配雌蛾被來自葡萄源的氣味所吸引,10%的試蟲徑直逆風上行180cm以上,降落在葡萄上后產(chǎn)卵(圖2:A);葡萄頂空收集物經(jīng)電子微形噴霧器噴灑后,也有效地吸引雌蛾逆風上行至氣味源(圖2:B),且與葡萄本身吸引的雌蟲數(shù)沒有差別,這表明頂空收集物捕獲了葡萄揮發(fā)物的關(guān)鍵成分。其中(E)-?-石竹烯的含量最豐富。而且雌蟲飛向誘源的行為反應與雄蟲定向飛向雌蟲釋放的性信息素的行為表現(xiàn)有相似之處。含有(E)-?-石竹烯,(E)-?-金合歡烯和DMNT3種化合物的混合物是吸引雌蟲逆風上行和降落產(chǎn)卵的關(guān)鍵成分。而且配比同樣重要,在配比是100︰78︰9的情形下比37︰17︰100的配比吸引了更多雌蟲降落,相反,后者不能誘發(fā)葡萄藤蛾的定向行為(圖2:C)。該研究表明,植物界中普遍存在的一些化合物,只因組分的配比特異性,僅以低至昆蟲性信息的微小含量就可引起特定昆蟲的的行為反應。對它們配比的研究將會幫助我們理解昆蟲與植物之間微秒的相互關(guān)系。4采用石塊法的優(yōu)勢和應用注意事項4.1環(huán)境條件和田間實驗的比較昆蟲向著氣味源的逆風飛行是一種高度綜合的行為,對任何微小的變化都非常敏感,人們?yōu)橛^察這些微小變化及其原因,設(shè)計和應用了風洞。對飛行生物如昆蟲進行化學通訊行為的測定,風洞實驗比野外研究有明顯的優(yōu)越性(閆鳳鳴,2011):第一,環(huán)境條件可以人為控制,可以一次設(shè)定一個可變的條件,其它條件可以固定,這樣可以比較容易找出影響昆蟲飛行的因素,獲得它們與行為變化間的聯(lián)系;每次實驗中溫度、濕度、風速和攜有化學物質(zhì)的氣流可以保持一致,不必像在田間那樣考慮這些條件的變化。第二,雖然風洞無法同時再現(xiàn)田間那樣寬的氣縷(Plume)和遠距離傳送的低濃度信息化學物質(zhì),但應用可變的釋放速率,也可以使昆蟲表現(xiàn)出對遠或近距離的行為反應;在昆蟲飛行時移動風洞底部的可視圖版,同樣可以模擬昆蟲遠距離的飛行。第三,風洞實驗可以常年進行,而田間實驗則受季節(jié)的限制。第四,風洞是一個非常靈敏的裝置,可以測定幾個納克的化學物質(zhì)引起的昆蟲的行為反應。但是,利用風洞進行研究也有不足之處,例如需要定期清潔等。4.2有利于其它昆蟲的生長和調(diào)節(jié)在國內(nèi)應用風洞的不多,多數(shù)應用嗅覺儀進行生測。風洞和嗅覺儀均是利用昆蟲對于揮發(fā)性氣味的趨性,研究化學物質(zhì)對于昆蟲行為的影響,但又各有優(yōu)缺點,了解了這些特點,有助于在研究中選擇合適的技術(shù)手段。第一,嗅覺儀小巧靈活,設(shè)計、制作和使用都很方便,形式也有很多種,清洗簡便,不需占用很多空間;而風洞雖然也有多種形式,有大有小,但總的來說屬于大型設(shè)備,需要專門的房間,維護相對比較麻煩;第二,嗅覺儀適合研究小型昆蟲的行為,而且可以測試成蟲或幼蟲,飛行的或爬行的昆蟲均可進行試驗;而風洞則適合于大型昆蟲,而且只能是可以飛行的昆蟲成蟲;第三,嗅覺儀可以測試揮發(fā)性化學物質(zhì)對于昆蟲的引誘或趨避活性(大部分用于引誘試驗),而風洞則只能進行引誘活性測定;第四,使用嗅覺儀進行的活性化學物質(zhì)對于昆蟲行為影響的測試相對比較粗放,只能觀察昆蟲的少數(shù)行為,而風洞則能比較精確地模擬田間條件,能夠觀察到昆蟲的多種行為反應,所以風洞試驗結(jié)果對于活性化學物質(zhì)的田間應用更有指導意義。4.3及時對昆蟲的行為測定設(shè)計風洞時,至少須考慮兩個方面:一是如何使空氣運動。建議用風扇送風,而不是抽風,因為如果抽風,空氣可能來自各個方面(如門、窗或墻縫等),任何干擾都可能影響實驗效果,為操作帶來很多不便。二是如何保持空氣清潔、沒有污染,因為如果空氣被污染,待測昆蟲會逐步產(chǎn)生適應,在正式測試時昆蟲的反應就會不靈敏。值得注意的是,昆蟲在風洞中的行為受很多因素的影響,如蟲齡。一般雄蛾對信息素的反應水平在羽化初期逐漸升高。因此,選擇合適日齡的成蟲進行行為測定非常關(guān)鍵。同時,還應避免同一性別不同個體間的干擾反應,在每次實驗過程中,放飛的雄蟲應有一定的時間間隔。而要研究雌蟲的產(chǎn)卵選擇行為,選擇適合狀態(tài)的雌蟲也非常關(guān)健,與未經(jīng)交配的處女雌蛾和交配后2d的煙草天蛾相比,交配3d的雌蛾逆風飛向盆栽寄主植物番茄的數(shù)量更多,并表現(xiàn)產(chǎn)卵行為(Mechaberetal.,2002)。交配狀態(tài)、風速、一天中測試的時間也都顯著影響測試昆蟲的行為反應(Chaetal.,2008)。對同一劑量的化學物質(zhì),一般至少測試20頭昆蟲。當遇到實驗結(jié)果不正常時,如懷疑化學物質(zhì)的成分或濃度是否適當,昆蟲反應是否正常時,可以使用正在求偶的雌蟲作為對照,以檢驗待測雄蟲是否有正常的行為反應。昆蟲對植物源化學物質(zhì)的反應不像對信息素那樣具有特異性,所以,在研究昆蟲對植物源化學物質(zhì)的反應時,可以首先使用植物植株作為氣味源,在下風口,釋放10頭左右的昆蟲,觀察昆蟲是否向植物定向飛行,5min或10min后檢查落在待測植物和對照植物上的昆蟲數(shù)量。當然,試蟲并不都表現(xiàn)出對氣味源直接的定向飛行行為,有的可能做非定向飛行(Mechaberetal.,2002)。4.4有機玻璃的凈化下面所列的要點,既是風洞試驗前的注意事項,同時也是風洞日常維護所要注意的方面(閆鳳鳴,2011):1)保持放置風洞的房間及風洞內(nèi)空氣的清潔;2)風洞房間內(nèi)應設(shè)有排氣扇,須常年運轉(zhuǎn)以避免污染;3)對風洞內(nèi)壁進行定期的清洗,每次實驗后也應立即清洗。玻璃的用丙酮擦洗;有機玻璃的用乙醇擦洗;4)風洞上風端的擋網(wǎng)易受污染,須定期用丙酮擦洗;5)風洞內(nèi)的各種配件如誘芯支架、釋放籠等在使用前用有機溶劑浸泡或高溫處理;6)至少在實驗前1~2h,將風扇打開,使空氣流通;7)選擇合適的風速并保持穩(wěn)定;不同昆蟲對風速的要求不同,風速過高或過低均影響昆蟲正常的行為反應。通常的風速在每秒幾十厘米的范圍內(nèi)。(1)實驗開始時,首先將待測樣品放在風洞的上風口;(2)等待1~2min,待氣跡均勻后,將試蟲放在下風口?？稍谙嘛L口正對氣味源的位置,放一個支架,將試蟲玻璃管水平放置在支架上,使試蟲的位置正好與氣味源處在一個水平上;可以通過觀察氫氧化銨或氨水的煙跡是否為有規(guī)律的圓錐形以及是否經(jīng)過放有試蟲的平臺來進一步確定試蟲的擺放位置;或在上風口燃燒一根香料棒也可以觀察氣跡的走向,以確定氣味源和試蟲的相對位置;(3)去掉玻璃管兩端的脫脂棉,讓昆蟲自由運動;(4)觀察、記錄昆蟲的反應。2.1.2雄器下風根據(jù)不同的昆蟲種類和待測化學物質(zhì)的性質(zhì),設(shè)計不同的觀察指標,如對蛾類昆蟲性信息素,可以觀