實(shí)驗(yàn)五：酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定抗血清效價(jià)

實(shí)驗(yàn)五

酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定抗血清效價(jià)

一、目的學(xué)習(xí)和掌握ELISA的基本原理間接ELISA重點(diǎn)掌握測(cè)定抗體效價(jià)的方法

測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。二、原理

其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。

其方法簡(jiǎn)單，方便訊速，特異性強(qiáng)。二、酶及其底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物，將得到不同的顏色反應(yīng).ELISA的種類和變化

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競(jìng)爭(zhēng)法（四）雙位點(diǎn)一步法（五）捕獲法測(cè)IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA

抗原酶標(biāo)抗體底物直接法原理

首先將抗原或抗體吸附在一個(gè)合適的固體載體表面上，洗滌

然后以酶標(biāo)記的抗原或抗體與被吸附的相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合形成有酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物，洗滌

當(dāng)加入適合底物時(shí)，復(fù)合物上的酶即催化底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生帶色的產(chǎn)物。因在一定條件下，酶降解底物的量與呈現(xiàn)的色澤成正比關(guān)系，因此通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定色度，即可計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原或抗體的含量?？乖豢姑笜?biāo)二抗底物間接法間接法的原理先將抗原吸附于載體表面，洗去未吸附的部分，然后加入待測(cè)血清，使其中的特異抗體蛋白（第一抗體）與抗原結(jié)合物，再洗去未結(jié)合的部分，加入酶抗體的抗體（第二抗體，即第一抗體的抗體），與抗原-抗體復(fù)合物相結(jié)合，產(chǎn)生酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，加入底物，在酶的催化下產(chǎn)生有色物質(zhì)，通過(guò)比色測(cè)定光密度值，即可算出抗血清中抗體的存在量?？寡逍r(jià)制備的免疫血清，必需進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定。抗血清的效價(jià)：它與一定量抗原作用時(shí)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)顏色反應(yīng)的最大稀釋度。分光光度計(jì)測(cè)定法：應(yīng)用一系列連續(xù)稀釋的抗血清，與固定的抗原反應(yīng)，分析計(jì)算出現(xiàn)顏色的最大稀釋度（吸光度差值需大于0.05）。三、操作步驟1.包被：96孔板包被適量BSA（100ul），4℃過(guò)夜。2.洗滌：漂洗3次，每次300ul，每次3min。3.一抗孵育：加入稀釋的一抗（100ul），37℃孵育1hr。4.洗滌：漂洗3次，每次300ul，每次3min。5.二抗孵育：加入稀釋的酶標(biāo)二抗（100ul），37℃孵育30min。6.洗滌：漂洗3次，每次300ul，每次3min。7.顯色反應(yīng)：加入顯色液200ul，避光顯色15min。8.終止：加入2N(N:當(dāng)量濃度)H2SO4

50ul，終止反應(yīng)。9.測(cè)定：酶標(biāo)儀讀數(shù)（OD490讀數(shù)