甜瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的aflp分析

甜瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的aflp分析

cucumismellol。2n.2x。24是葫蘆島科的一種一年生草本植物。在國內(nèi)外廣泛種植。這是一個(gè)重要的耕作因素之一。甜瓜無論從果實(shí)大小、形狀和風(fēng)味,還是植物學(xué)性狀和氣候適應(yīng)性都具有豐富的多樣性。1859年法國分類學(xué)家Naudin首次將甜瓜分為10個(gè)族,以后相繼又有分類學(xué)家對此進(jìn)行了修訂和完善。1989年,我國果樹育種學(xué)家林德佩在前人研究的基礎(chǔ)上將甜瓜分成5個(gè)亞種、8個(gè)變種。對于甜瓜的起源,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,非洲為甜瓜的初生起源中心,印度、中亞、西亞和東亞為甜瓜的次生起源中心。關(guān)于甜瓜遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究,國內(nèi)外已經(jīng)有一些報(bào)道,采用的方法有RAPD、RFLP、ISSR等分子標(biāo)記技術(shù),早期還有采用同功酶技術(shù)進(jìn)行分析研究。而使用AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism)分子標(biāo)記方法對甜瓜進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究尚未見報(bào)道。AFLP分子標(biāo)記技術(shù)于1993年由荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos共同創(chuàng)建,是RFLP和PCR相結(jié)合的一種技術(shù),兼具了RFLP的穩(wěn)定性和PCR的高效性,非常適合植物遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究。本研究廣泛收集了國內(nèi)外48份甜瓜種質(zhì)材料,一方面探討AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在甜瓜遺傳多樣性研究中的有效性,另一方面鑒定供試甜瓜材料的遺傳多樣性及親緣關(guān)系,為甜瓜種質(zhì)資源收集和保存提供參考,也為優(yōu)良種質(zhì)材料的開發(fā)、利用提供依據(jù)。1材料和方法1.1地區(qū)及植物來源試驗(yàn)共收集了國內(nèi)外甜瓜(CucumismeloL.)材料48份(表1,中國各地27份,美國8份,意大利5份,日本2份,法國、韓國、匈牙利、西班牙、南非、以色列各1份),種子均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甜瓜課題組。2005年春季,材料于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所實(shí)驗(yàn)農(nóng)場種植,每份材料種植20株。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1dna的提取從每份材料中選取具有代表性的植株5株,以植株幼嫩葉片為材料提取甜瓜基因組DNA。提取方法采用CTAB小量法,并加以改進(jìn)。提取完畢后,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度及純度,檢測后將每個(gè)樣品濃度均調(diào)至50ng/μL。1.2.2引物篩選及篩選AFLP參照Vos的方法,并進(jìn)行優(yōu)化。選用EcoRⅠ和MseⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切連接,預(yù)擴(kuò)增用E00/M00引物組合,選擇性擴(kuò)增采用E+2/M+3引物組合方式,共篩選引物64對。所有引物皆由上海生物工程有限公司合成,實(shí)驗(yàn)所用的內(nèi)切酶EcoRⅠ和MseⅠ為NEWENGLANDBioLabs產(chǎn)品,T4-DNA連接酶為Takala產(chǎn)品,Taq酶為上海Promega產(chǎn)品,dNTPs為TOYOBO公司產(chǎn)品。1.2.3銀染色試驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染檢測,照相并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。1.2.4多態(tài)率的計(jì)算選擇清晰可辨的電泳帶,在所有材料中同一個(gè)位點(diǎn)有帶的記為“1”,無帶的記為“0”,獲得由“0”、“1”組成的原始矩陣。計(jì)算多態(tài)率:P=(k/n)×100%,其中k為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù),n為所測得位點(diǎn)總數(shù)。用MEGA2.1聚類分析軟件,采用p-distance距離系數(shù)模型進(jìn)行UPGMA分析,生成聚類圖。2結(jié)果與分析2.1引物組合對甜瓜材料多態(tài)性的影響從供試材料中選取4份來源不同,并且表型差異較大的材料(B1、H27、H53、M40),對64個(gè)引物組合進(jìn)行了篩選,結(jié)果顯示所有引物組合在4份供試材料中均能找到具有多態(tài)性的條帶。從中選擇多態(tài)性豐富、擴(kuò)增譜帶清晰的引物組合10個(gè),用于48份甜瓜材料的遺傳分析(圖1)。共擴(kuò)增出423條帶,其中多態(tài)性條帶為172條,多態(tài)率為40.66%。擴(kuò)增多態(tài)率最高的引物組合為E13/M66,多態(tài)率達(dá)52.50%;最低的引物組合為E23/M47,多態(tài)率為34.21%(表2)。2.2第1組材料組成聚類分析結(jié)果將供試材料分成了兩大類群(圖2),分別為厚皮甜瓜類群和薄皮甜瓜類群。厚皮甜瓜類群進(jìn)一步可以分成4個(gè)亞類:第Ⅰ亞類包括26份種質(zhì),這26份種質(zhì)又包括2種類型:第一組類型由H13、H30、H08、H11、H50、H09、H28、H02、H57、H58、M02、M05、M08、H03、H55、H52、H51、H56共18份材料組成,屬于光皮甜瓜類型;另一組包括H01、H35、H25、H36、H42、H06、H26、H18共8份材料,屬于網(wǎng)紋甜瓜類型。第Ⅱ亞類共有4份種質(zhì),包括H07、H21、H24、H60,均為來自印度野生種質(zhì)資源后代的自交材料,分類學(xué)上屬于具有抗白粉病,結(jié)實(shí)花為單雌性,果實(shí)面酸等共同特征。第Ⅲ亞類共6份種質(zhì),包括:H59、H33、H37、M13、M15和M40,其中來自意大利的種質(zhì)有3份,它們之間遺傳關(guān)系較近,M15、M40之間的遺傳距離為0.120,二者與M13的遺傳距離分別是0.133和0.173。第Ⅳ亞類有4份種質(zhì),包括來自美國的B15和H27,來自中國的H53和來自匈牙利的H32。在薄皮甜瓜類群中,有3份甜瓜種質(zhì)(編號B01、B03、B53)與其它種質(zhì)遺傳距離較遠(yuǎn),這3份種質(zhì)材料分別來自中國陜西、上海和日本,其余的5份材料來自中國河北,材料間親緣關(guān)系相對較近,尤其是B09和B11在所有材料中遺傳距離最近為0.040。3討論3.1檢測結(jié)果難以區(qū)分本研究采用AFLP分子標(biāo)記方法對甜瓜遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行了分析,每對引物擴(kuò)增的總帶數(shù)在40條左右,平均多態(tài)率為40.66%。該結(jié)果比同樣使用AFLP方法,在其它作物上檢測到的結(jié)果要低。原因在于銀染顯影方法,主要檢測DNA片段大小在100～600bp之間的條帶,當(dāng)片段大于600bp時(shí),條帶間距離較近,難以區(qū)分;而小于100bp時(shí),圖譜條帶多不清晰;即使片段大小在100～600bp之間的條帶有些也會出現(xiàn)可辨度低的情況。因此,在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí),只選用了片段大小在100～600bp之間,且清晰可辨的條帶,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。3.2材料的分子聚類和優(yōu)良性狀本研究聚類分析得到的分類結(jié)果與傳統(tǒng)的甜瓜分類結(jié)果基本一致,即材料可分為厚皮甜瓜和薄皮甜瓜兩大類群。研究中也有個(gè)別種質(zhì)與按表型特征分類的結(jié)果不同,如B15按表型特征為薄皮甜瓜種質(zhì)材料,但被聚到厚皮甜瓜類群之中,因B15正是厚皮甜瓜和薄皮甜瓜的雜交后代,在多代自交之后仍具有兩者共同的遺傳特性,這證明甜瓜材料B15雖然按照果皮特征分類,可以歸為薄皮甜瓜類型,但是在綜合特征及分子水平上更接近于厚皮甜瓜。這也更進(jìn)一步證實(shí)了分子水平分類的準(zhǔn)確性,能夠更加準(zhǔn)確地揭示材料之間的內(nèi)在遺傳聯(lián)系,類似結(jié)果在劉萬勃的研究中也有出現(xiàn)。供試材料中還包括幾份親本及其雜交材料,如H51、H52、H56分別為H02和H03的正反交F1代及回交1代,由聚類結(jié)果可以看出,H51、H52和H56均與親本之一的H03親緣關(guān)系較近,H56與H51間親緣關(guān)系最近,遺傳距離為0.080。這與樂錦華等對厚皮甜瓜親緣關(guān)系的研究結(jié)果類似,即雜交后代易與雙親或是親本之一聚在一起。我國是薄皮甜瓜的次生起源中心之一,眾多的薄皮甜瓜種類分布在東北、華南以及中西部地區(qū)。各地之間相互引種,同物異名現(xiàn)象在甜瓜種質(zhì)中