熒光定量PCR的CT值

檢驗熒光定量PCR的CT值來源：原博士帶你做檢測PART

01Ct值的基本概念PART

02與Ct值有關的參數(shù)PART

03Ct值與模板拷貝數(shù)的關系PART

04關于qPCR中Ct值的幾點思考CONTENTS目錄PARTONECT值的基本概念PARTONECT值的基本概念

閾值循環(huán)數(shù)Thresholdcycle(Ct)也寫作Cq值，熒光信號大于熒光閾值時PCR循環(huán)數(shù)。儀器軟件通常將第3-15個循環(huán)的熒光值設為基線（baseline），是由于測量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調節(jié)。高于閾值的熒光信號被認為是真實的信號，用于定義Ct值。Ct會受到閾值的影響，每次試驗由于樣品和儀器的不同會導致基線不同，進而影響閾值和Ct值。PARTONECT值的基本概念Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍，Ct值也會存在差異。模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關系,起始模板量濃度越高，Ct值越?。黄鹗寄０辶繚舛仍降?，Ct值越大。PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現(xiàn)性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩(wěn)定的。PART與Ct值有關的參數(shù)TWO標準曲線Standardcurve：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值。相關系數(shù)Correlationcoefficient(R^2)：反映了標準曲線的線性，通常要求>0.99。發(fā)展成果斜率Slope：當擴增效率為100%時斜率為-3.32，當90%-110%時的斜率為-3.58~-3.10。擴增效率Efficiency(E)：通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。PARTCt值與模板拷貝數(shù)的關系PARTTHREECt值與模板拷貝數(shù)的關系理想情況下：擴增產(chǎn)物量Cn=起始模板量C1×（1+擴增效率E）^循環(huán)數(shù)n實際情況下：由于E通常無法達到100%，并且在擴增的后期，擴增效率會逐漸降低。因此，只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始濃度差2倍。PARTTHREECt值與模板拷貝數(shù)的關系

目前最常用的qPCR定量的方法，即用已知濃度的標準品與未知濃度樣品同時擴增，將未知濃度樣品的Ct值代入該標準曲線獲得未知樣品濃度。分析定量時，一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量結果的不準確。標準曲線需滿足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58~-3.10。同時定量標準品的量值需要準確可靠。用qPCR進行定量，理論上可行，實際上很難獲得準確的定量結果。PART關于qPCR中Ct值的幾點思考網(wǎng)絡推廣聯(lián)盟思考PARTFOUR關于qPCR中Ct值的幾點思考1、Ct值能否直接換算成模板拷貝數(shù)？2、熒光定量PCR是否為定量方法？3、Ct值能否作為評價qPCR試劑盒的指標？4、能否通過增加擴增循環(huán)數(shù)來增加試劑盒的敏感性？PARTFOUR工作概述1、Ct值能否直接換算成模板拷貝數(shù)？通過制作標準曲線（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58~-3.10）的方法可以獲得未知樣品的初始模板拷貝數(shù)，前提是需要樣品與標準品同時擴增，定量標準品需要使用標準物質等定量準確的物質（OD260/280換算的的拷貝數(shù)誤差很大），即使如此定值結果仍存在一定的誤差。PARTFOUR工作概述2、熒光定量PCR是否為定量方法？雖然名字里有“定量”，但是qPCR的間接定量方式又復雜，又受很多因素影響，又不準確，在計量領域是不被認可的。目前的核酸檢測方法中只有數(shù)字PCR是真正的定量檢測方法，其余的都是定性檢測方法。PARTFOUR工作概述3、Ct值能否作為評價qPCR試劑盒的指標？qPCR試劑的評價需要從分析敏感性（最低檢測限），分析特異性（交叉反應），重復性（精密度），診斷敏感性，診斷特異性等多個指標去衡量。僅憑Ct值的高低去判斷一個qPCR試劑盒的優(yōu)劣太片面，不同試劑盒的Ct值不具有可比性。有些試劑盒采取先進行幾個循環(huán)的預擴增，再進行正式循環(huán)的做法就是為了使Ct值看起來更低。PARTFOUR工作概述4、能否通過增加擴增循環(huán)數(shù)來增加試劑盒的敏感性？（1）從原理上解釋理論上，假設初始模板量為1個拷貝，酶的擴增效率100%，到達最大閾值約需要35個循環(huán)，因此業(yè)內(nèi)通常認為qPCR的有效線性范圍為Ct:15-35。通常酶的擴增效率無法達到100%，達到1個拷貝模板的循環(huán)數(shù)可能會達到38或更高，當酶的效率更低或者存在抑制劑時，檢測到1拷貝模板的循環(huán)數(shù)的Ct值可能會更高。當初始模板核酸濃度≤1copies/μL時，這時的影響因素不光是你能否檢測到，還取決于你每次能取到模板的概率。因為在低濃度下，每次取到模板的概率是服從泊松分布的。PARTFOUR工作概述4、能否通過增加擴增循環(huán)數(shù)來增加試劑盒的敏感性？（2）qPCR循環(huán)數(shù)試驗模板濃度：將標準物質稀釋為0.5，1，2，3，4，5copies/μL，模板上樣量2μL，每個濃度10次重復。擴增體系：使用相同的引物探針和擴增體系進行擴增，擴增體系體積為20μL。該擴增體系的R^2=0.997,E=92.57%,斜率-3.51。循環(huán)數(shù)：分別進行40個循環(huán)和45個循環(huán)，其他條件完全一致。PARTFOUR工作概述4、能否通過增加擴增循環(huán)數(shù)來增加試劑盒的敏感性？（2）qPCR循環(huán)數(shù)試驗試驗結果：（1）最低檢測限：40個循環(huán)和45個循環(huán)的最低檢測限均為3copies/μL；（2）低濃度模板的陽性檢出率：2，1，0.5copies/μL的陽性檢出率完全相同，分別為90%，70%，60%；（3）平均值，SD，CV：將兩者平均值做配對T檢驗的P值為0.002，差異極顯著，45個循環(huán)的平均值普遍比40個循環(huán)的平均值高0.