細(xì)胞培養(yǎng)綜述

細(xì)胞培養(yǎng)綜述摘要：為了模擬機(jī)體生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。培養(yǎng)出的活細(xì)胞含有量大、均一和可重復(fù)性的特點(diǎn)，能夠通過多個(gè)物理、化學(xué)、生物等因素進(jìn)行調(diào)控，并且能夠通過倒置、熒光、電子、激光共焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等多樣的辦法進(jìn)行研究，已廣泛運(yùn)用在不同科學(xué)研究領(lǐng)域。核心詞：分化，細(xì)胞分型，生長增殖過程，傳代一、體、外細(xì)胞的差別和分化1、差別：細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的互相影響，生活在缺少動(dòng)態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生以下變化：分化現(xiàn)象削弱；形態(tài)功效趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長的持續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系[1]。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體細(xì)胞相似的基本構(gòu)造和功效，也有某些不同于體細(xì)胞的性狀。事實(shí)上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差別就開始發(fā)生了。即使體外細(xì)胞與機(jī)體細(xì)胞存有差別，但并未失去研究的意義。且不管其有許多性狀仍與體相似（如體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞仍可博動(dòng)），只從細(xì)胞遺傳學(xué)（Cyto－genetics）的角度看，離體細(xì)胞仍帶有全套的二倍體基因。細(xì)胞在培養(yǎng)中的體現(xiàn)，只但是是對應(yīng)基因關(guān)閉／啟動(dòng)引發(fā)的現(xiàn)象，這并非是絕對缺點(diǎn)。恰恰相反，在培養(yǎng)的細(xì)胞中某些特定功效的喪失，可為該基因的體現(xiàn)與調(diào)控提供線索。2、分化；體外培養(yǎng)的細(xì)胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的政變，細(xì)胞分化的體現(xiàn)和在體不同。細(xì)胞與否體現(xiàn)分化核心在于與否存在使細(xì)胞分化的條件，如Friend細(xì)胞（小鼠紅白血病細(xì)胞）在一定的因素作用下能夠合成血紅蛋白，血管皮細(xì)胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時(shí)能長成血管狀構(gòu)造，雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體，這些均屬于細(xì)胞分化行為[2]。二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能接體組織學(xué)標(biāo)推鑒定，僅大致分成下列四型：1、成纖維細(xì)胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)來源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞。

2、上皮型細(xì)胞：細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處在膜邊沿的細(xì)胞總與膜相連，極少單獨(dú)行動(dòng)。來源于、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)[3]。

3、游走細(xì)胞型：呈散在生長，普通不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其它細(xì)胞相區(qū)別。4、多型細(xì)胞型：有某些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以擬定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于這類。（二）懸浮型；見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程(一）在細(xì)胞全生存過程中，大致都經(jīng)歷下列三個(gè)階段：1．原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期：也稱初代培養(yǎng)，即從體取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，普通持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體原組織在形態(tài)構(gòu)造和功效活動(dòng)上相似性大。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體細(xì)胞性狀相似性大，是檢測藥品較好的實(shí)驗(yàn)對象。2．傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長。在培養(yǎng)條件較好狀況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（DiploidCellLine）。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。如不凍存，則需重復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能造成細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。普通狀況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐步緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。3．衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)狀況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（SpontaneousTransformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系（InfiniteCellLine），也稱持續(xù)細(xì)胞系（ContinuousCellLine）。無限細(xì)胞系的形成重要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工辦法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能含有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀[4]。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期普通要通過下列三個(gè)階段：1．潛伏期（LatentPhase）：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先通過一種在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長達(dá)10～24小時(shí)或更多；持續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快，10～30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一種非常復(fù)雜和與多個(gè)因素有關(guān)的過程。支持物能影響細(xì)胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有某些特殊物質(zhì)如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（LargerExternalTransformationSubstance），細(xì)胞表面蛋白（CellSurfaceProtein：CSP）等也參加貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面（如CSP），有的則來自培養(yǎng)基中的血清（LETS）。近年又從多個(gè)不同組織和生物成分中提取出了諸多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細(xì)胞生長增殖條件之一。細(xì)胞貼附于支持物后，除先通過前述延展過程變成極性細(xì)胞，還要通過一種潛伏階段，才進(jìn)入生長和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí)，可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，基本無增殖，少見分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等親密有關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約24～96小時(shí)或更長，持續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短[5]。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐步增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。2．指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）：這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為鑒定細(xì)胞生長旺盛與否的一種重要標(biāo)志。普通以細(xì)胞分裂（MitoticIndex：MI）表達(dá)，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多個(gè)因素的影響。普通細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，持續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動(dòng)對細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力最佳的時(shí)期，因此是進(jìn)行多個(gè)實(shí)驗(yàn)最佳的和最重要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜狀況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不停增多、生長空間漸趨減少、最后細(xì)胞互相接觸匯合成片。細(xì)胞互相接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的互相接觸能克制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸克制（ContactInhibition）。而惡性細(xì)胞則無接觸克制現(xiàn)象，因此接觸克制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。腫瘤細(xì)胞由于無接觸克制能繼續(xù)移動(dòng)和增殖，造成細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（Piledup）[6]。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸克制，只要營養(yǎng)充足，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代物的影響，則發(fā)生密度克制（DensityInhibition），造成細(xì)胞分裂停止。3．停滯期（StagnatePhase）：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代產(chǎn)物積累、pH減少。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)變化，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種狀況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，最少還要再傳1～2兩代，通過換液裁減掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才干再用。四、細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)與無菌操作（一）注意事項(xiàng)1、自取材開始，保持全部組織細(xì)胞處在無菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。2、在超凈臺(tái)中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。3、凡在超凈臺(tái)外操作的環(huán)節(jié)，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以避免細(xì)菌落入。（二）無菌操作1、操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。2、點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長，以免退火，并冷卻后才干夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用品不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。3、操作動(dòng)作要精確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上用品要布局合理。5、瓶子開口后要盡量保持45°斜位。6、吸溶液的吸管等不能混用。參考文獻(xiàn)：[1].JohnR.W.Masters，BernhardO.Palsson.HumanCellCulture.KluwerAcademicPublishers，1999－[2].R