細胞培養(yǎng)綜述

細胞培養(yǎng)綜述摘要：為了模擬機體生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。培養(yǎng)出的活細胞含有量大、均一和可重復(fù)性的特點，能夠通過多個物理、化學(xué)、生物等因素進行調(diào)控，并且能夠通過倒置、熒光、電子、激光共焦顯微鏡、流式細胞術(shù)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標記等多樣的辦法進行研究，已廣泛運用在不同科學(xué)研究領(lǐng)域。核心詞：分化，細胞分型，生長增殖過程，傳代一、體、外細胞的差別和分化1、差別：細胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞間的互相影響，生活在缺少動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生以下變化：分化現(xiàn)象削弱；形態(tài)功效趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長的持續(xù)細胞系或惡性細胞系[1]。因此，培養(yǎng)中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持著與體細胞相似的基本構(gòu)造和功效，也有某些不同于體細胞的性狀。事實上從細胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差別就開始發(fā)生了。即使體外細胞與機體細胞存有差別，但并未失去研究的意義。且不管其有許多性狀仍與體相似（如體外培養(yǎng)的心肌細胞仍可博動），只從細胞遺傳學(xué)（Cyto－genetics）的角度看，離體細胞仍帶有全套的二倍體基因。細胞在培養(yǎng)中的體現(xiàn)，只但是是對應(yīng)基因關(guān)閉／啟動引發(fā)的現(xiàn)象，這并非是絕對缺點。恰恰相反，在培養(yǎng)的細胞中某些特定功效的喪失，可為該基因的體現(xiàn)與調(diào)控提供線索。2、分化；體外培養(yǎng)的細胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的政變，細胞分化的體現(xiàn)和在體不同。細胞與否體現(xiàn)分化核心在于與否存在使細胞分化的條件，如Friend細胞（小鼠紅白血病細胞）在一定的因素作用下能夠合成血紅蛋白，血管皮細胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時能長成血管狀構(gòu)造，雜交瘤細胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體，這些均屬于細胞分化行為[2]。二、體外培養(yǎng)細胞的分型（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態(tài)時不能接體組織學(xué)標推鑒定，僅大致分成下列四型：1、成纖維細胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)來源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。

2、上皮型細胞：細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處在膜邊沿的細胞總與膜相連，極少單獨行動。來源于、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)[3]。

3、游走細胞型：呈散在生長，普通不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其它細胞相區(qū)別。4、多型細胞型：有某些細胞，如神經(jīng)細胞難以擬定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于這類。（二）懸浮型；見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。三、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程(一）在細胞全生存過程中，大致都經(jīng)歷下列三個階段：1．原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期：也稱初代培養(yǎng)，即從體取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，普通持續(xù)1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細胞與體原組織在形態(tài)構(gòu)造和功效活動上相似性大。初代培養(yǎng)細胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細胞和體細胞性狀相似性大，是檢測藥品較好的實驗對象。2．傳代期：初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好狀況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系（DiploidCellLine）。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。如不凍存，則需重復(fù)傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能造成細胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。普通狀況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐步緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。3．衰退期：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數(shù)狀況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（SpontaneousTransformation）。轉(zhuǎn)化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系（InfiniteCellLine），也稱持續(xù)細胞系（ContinuousCellLine）。無限細胞系的形成重要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細胞轉(zhuǎn)化亦可用人工辦法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細胞也可能含有惡性性質(zhì)。細胞永生性和惡性性非同一性狀[4]。（二）組織培養(yǎng)細胞一代生存期普通要通過下列三個階段：1．潛伏期（LatentPhase）：細胞接種培養(yǎng)后，先通過一種在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。初代培養(yǎng)細胞貼附慢，可長達10～24小時或更多；持續(xù)細胞系和惡性細胞系快，10～30分鐘即可貼附。細胞貼附現(xiàn)象是一種非常復(fù)雜和與多個因素有關(guān)的過程。支持物能影響細胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有某些特殊物質(zhì)如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（LargerExternalTransformationSubstance），細胞表面蛋白（CellSurfaceProtein：CSP）等也參加貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細胞膜的表面（如CSP），有的則來自培養(yǎng)基中的血清（LETS）。近年又從多個不同組織和生物成分中提取出了諸多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細胞生長增殖條件之一。細胞貼附于支持物后，除先通過前述延展過程變成極性細胞，還要通過一種潛伏階段，才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時，可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等親密有關(guān)。初代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，持續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短[5]。當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐步增多時，標志細胞已進入指數(shù)增生期。2．指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）：這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為鑒定細胞生長旺盛與否的一種重要標志。普通以細胞分裂（MitoticIndex：MI）表達，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)受細胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多個因素的影響。普通細胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數(shù)低，持續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂指數(shù)可高達3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細胞一代中活力最佳的時期，因此是進行多個實驗最佳的和最重要的階段。在接種細胞數(shù)量適宜狀況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細胞數(shù)量不停增多、生長空間漸趨減少、最后細胞互相接觸匯合成片。細胞互相接觸后，如培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的互相接觸能克制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸克制（ContactInhibition）。而惡性細胞則無接觸克制現(xiàn)象，因此接觸克制可作為區(qū)別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無接觸克制能繼續(xù)移動和增殖，造成細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積（Piledup）[6]。細胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸克制，只要營養(yǎng)充足，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數(shù)量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代物的影響，則發(fā)生密度克制（DensityInhibition），造成細胞分裂停止。3．停滯期（StagnatePhase）：細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代產(chǎn)物積累、pH減少。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)變化，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種狀況下，雖進行了傳代，因細胞已受損，需要恢復(fù)，最少還要再傳1～2兩代，通過換液裁減掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復(fù)后，才干再用。四、細胞培養(yǎng)的注意事項與無菌操作（一）注意事項1、自取材開始，保持全部組織細胞處在無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。2、在超凈臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。3、凡在超凈臺外操作的環(huán)節(jié)，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以避免細菌落入。（二）無菌操作1、操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。2、點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才干夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用品不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。3、操作動作要精確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。5、瓶子開口后要盡量保持45°斜位。6、吸溶液的吸管等不能混用。參考文獻：[1].JohnR.W.Masters，BernhardO.Palsson.HumanCellCulture.KluwerAcademicPublishers，1999－[2].R