?；o酶硫酯酶在脂肪酸代謝中的作用

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1?；趸竌硫酯酶a氨基丙烯酸酶（aco3）廣泛出現(xiàn)于原核生物和真核生物中，并存在于真核生物的細胞液、長江三角洲和其他代謝體中。酰基輔酶A硫酯酶按照系統(tǒng)命名法進行了劃分,人類中相關(guān)的酶用大寫字母表示(如ACOT1),大鼠和小白鼠中的酶使用小寫字母表示(Acot1)。Acots按照酶的分子量分為兩類(類型Ⅰ和類型Ⅱ),類型Ⅰ包含Acotl-Acot6,類型Ⅱ有Acot7-Acot13。兩類Acots之間沒有明顯的序列相似性,但是各個類內(nèi)部的酰基輔酶A硫酯酶擁有高度的序列相似性。酰基輔酶A硫酯酶能夠催化水解?；o酶A酯類中的硫酯鍵來產(chǎn)生輔酶A(CoASH以及相應的非酯化的脂肪酸。Acots催化各種輔酶A酯類的復合物,包括飽和的、不飽和的和支鏈的脂肪酸,膽汁酸,二羧酸和前列腺素。目前在哺乳動物中檢測到的含有?；o酶A的組織和器官有大腦、肝臟、腎、心臟、肺和生成固醇類的組織中等。?；o酶A硫酯酶1(ACOT1/Acot1,以前也被稱作CTE-1,LACH2和ACH2),在小鼠的大腦、心臟、肝臟和睪丸內(nèi)均有發(fā)現(xiàn),這種細胞質(zhì)酶主要催化飽和的脂肪族的酰基輔酶A酯類的水解,在鼠科中酶的含量受到高濃度的底物的抑制(小白鼠和大鼠中的長鏈?；o酶A的濃度分別大于20μM和50μM),此外,這種酶的表達還受到空腹和糖尿病的誘導。人類基因組中編碼4種I型的?；o酶A硫酯酶(ACOT1,ACOT2,ACOT4,ACOT6),這幾種酶之間的序列具有高度的保守性,但是每種酶都催化不同的底物。這些酶在C末端包含一個α/β水解酶區(qū)域并且包含一個Ser-His-Asp的催化三聯(lián)體氨基酸,在酶的N端包含一個“β-三明治”區(qū)域。到目前為止,I型的?；o酶A硫酯酶的晶體結(jié)構(gòu)只有ACOT2的晶體結(jié)構(gòu)得到了解析。本文利用生物信息學的方法得到了ACOT1中存在的有害突變的蛋白序列,利用同源建模的方法得到了ACOT1和ACOT1＿MULT的結(jié)構(gòu)模型,計算并分析了突變對蛋白結(jié)構(gòu)的影響,從非共價鍵之間的相互作用探究了造成這種結(jié)果的原因。本文的研究結(jié)果對于闡明序列突變對蛋白結(jié)果和功能的影響具有很好的借鑒意義,同時,為基于新形成的活性口袋的藥物的篩選工作提供了很好的靶點。2方法2.1生物信息學的相關(guān)分析本研究從/Multigenome＿summaries/網(wǎng)站中下載了公共數(shù)據(jù)Complete＿PublicGenomes54genomes＿B37＿mkvcf.vcf數(shù)據(jù)進行生物信息＿＿學的相關(guān)分析,首先對變異中的數(shù)據(jù)進行功能篩選,保留發(fā)生的非同義突變,影響剪切位點及導致獲得終止密碼子的SNP位點,然后對保留的SNP數(shù)據(jù)進行雜合度的篩選,將突變中的發(fā)生純合突變的SNP進行保留,利用ANNOVAR對保留的SNP進行功能注釋,并用SIFT,PolyPhen2,LRT,MutationTaster這4款軟件對保留的SNP進行氨基酸置換預測,4個軟件均預測到了ACOT1中的有害突變位點c.G565A:p.A189T。2.2模型的建立與序列的優(yōu)化已有文獻報道ACOT1和ACOT2的序列同源性為93%,利用同源建模軟件Modeller以ACOT2的晶體結(jié)構(gòu)中的A鏈為模板,構(gòu)建出了ACOT1的野生型(ACOT1)和突變型(ACOT1＿MULT)模型,由于ACOT2的晶體結(jié)構(gòu)中殘基HIS437-GLY441部分缺失,在同源建模的過程中,為了使構(gòu)建的模型更準確,我們對ACOT1模型中相應的序列進行了優(yōu)化,并選擇其中能量最低的構(gòu)象作為分子動力學模擬的初始結(jié)構(gòu)。2.3水進行區(qū)域能量的大力前處理動力學模擬過程中使用GROMACS軟件包作為處理蛋白的主要程序,采用Amber力場中的ff99SB力場用于描述ACOT1中的參數(shù),為了使體系呈電中性,模擬前加入抗衡離子Na+來中和體系,采用含有TIP3P水分子的立方體的水盒子模型,溶質(zhì)同水盒子邊緣之間的最小間距設定為10。組氨酸的離子狀態(tài)通過使用GROMACS中的程序pdb2gmx程序來決定,組氨酸的質(zhì)子化狀態(tài)通過整個體系的氫鍵網(wǎng)絡按照一個簡單的幾何學標準來決定。為了移除體系中的空間位阻,采用下面的方法進行體系的最小化:先固定體系中的蛋白結(jié)構(gòu)進行5000步的最陡下降法的能量優(yōu)化,接著進行5000步的共軛梯度法的能量優(yōu)化,最后在不加限制的情況下重復上面的2個過程。在優(yōu)化之后,將體系在NVT系宗中從0K加熱到300K。模擬前體系進行500ps的構(gòu)象平衡,模擬過程中采用PME(ParticleMeshEwald)算法來非鍵結(jié)的相互作用,閾值設置為10A,采用SHAKE算法來處理與H原子共價相連的原子,積分步長設置為2fs,每2ps保存一次軌跡坐標。蛋白結(jié)構(gòu)的可視化軟件選用VMD。3實驗與結(jié)果分析3.1n端區(qū)域?qū)钚灾行姆€(wěn)定活性區(qū)域的作用ACOT1具有和ACOT2相同的N端區(qū)域和C端區(qū)域,其中N端區(qū)域包含一個“β-三明治”區(qū)域,由7個β折疊組成,其中一個P折疊片由3個短的β折疊組成,另外一個β折疊片由4個長的β折疊組成,雖然N端區(qū)域并不是組成活性中心區(qū)域的部分,但第4個和第5個β折疊之間的長Loop區(qū)域,對于穩(wěn)定活性區(qū)域有重要的作用(如圖1)。C末端區(qū)域包含α/β水解酶區(qū)域,中心部分包含8個β折疊和5個α螺旋,這8個β折疊被5個α螺旋所包裹,并且這8個β折疊是相互平行的,活性中心位于連接α螺旋和β折疊的Loop區(qū)域,由一個三聯(lián)體的氨基酸組成,分別為SER232,ASP326和HIS360。活性中心的上部有一個Loop形成的“蓋子”(LEU374-SER380),這個“蓋子”區(qū)域起到了保護活性中心的作用。氨基酸的突變位點發(fā)生在α/β水解酶區(qū)域的第4個β折疊的末端氨基酸ALA189位置。3.2結(jié)構(gòu)波動情況在動力學過程中,為了查看體系最終是否達到了穩(wěn)定的狀態(tài),分別計算了2個體系中殘基的α碳相對于模擬初始結(jié)構(gòu)的均方根偏差(RootMeanSquareDeviation,RMSD)的波動情況,圖2顯示了野生型體系和突變體系殘基的Cα原子的坐標相對于初始結(jié)構(gòu)的變化情況,從圖中可以看出,當模擬時間達到7ns時2個體系慢慢向平衡過渡,當模擬時間達到8ns時,2個體系均已達到了穩(wěn)定狀態(tài)。ACOT1和ACOT1＿MULT,2個體系穩(wěn)定時的RMSD分別為2.3A和2.1。3.3模擬參數(shù)設置上的氫鍵氫鍵在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性上起到了重要的作用,由于突變位點發(fā)生在一個β折疊的末端,并且突變后的氨基酸蘇氨酸(THR189)為極性的親水性氨基酸,含有極性的羥基基團,為了研究殘基突變后對氫鍵造成的影響,分析了ACOT1和ACOT1＿MULT體系中突變附近的氫鍵在分子動力學中的氫鍵的數(shù)量以及氫鍵所占的百分比(如表1所示)。分子動力學過程中,ACOT1體系在ALA189殘基附近形成的氫鍵有PHE164-TYR190,GLU194-ARG140和ASP195-ARG145。ACOT1＿MULT體系在相應的突變位置THR189殘基附近形成的氫鍵有PHE164-TYR190,GLY169-THR189,GLU194-ARG140和ASP195-ARG145。從表中可以發(fā)現(xiàn),氨基酸突變后,THR189與相鄰的160Loop區(qū)域的氨基酸GLY169形成了新的氫鍵,模擬過程中氫鍵所占的百分比為74%。通過進一步的分析發(fā)現(xiàn),由于模擬的初始階段殘基之間的位置取向的原因使得在模擬的前1ns的時間內(nèi)并沒有氫鍵的形成,但在后面的模擬過程中氫鍵所占的比例達到了80%～95%之間,說明了THR189-GLY169在模擬過程中形成了穩(wěn)定的氫鍵。由于ARG140位于α/β水解酶區(qū)域的第一個β折疊片末端的位置,GLU194和ARG140殘基位于突變位置所在的Loop區(qū)上。ARG145殘基位于第2個β折疊片初始的位置,突變前后GLU194-ARG140之間氫鍵所占比率的上升和ASP195-ARG145之間氫鍵所占比率的下降更有利于突變位置附近的β折疊和160Loop區(qū)域向外部的極性溶劑的方向發(fā)生扭轉(zhuǎn)。3.4模型結(jié)構(gòu)距離分析疏水相互作用也是穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的又一重要的因素,在模擬過程中,本研究分析了位于活性中心上面的“蓋子”區(qū)域(對應的殘基為LEU374-SER380)與相鄰160Loop(α/β水解區(qū)域的第3個β折疊的末端區(qū)域)區(qū)域之間的疏水相互作用的變化。為了便于研究疏水相互作用,分別從2個Loop區(qū)域中選取了2個具有代表性的殘基的中心作為計算相互之間距離的端點,“蓋子”區(qū)域選取的殘基為ALA376和LEU377,相鄰的Loop區(qū)選取的代表性的殘基為GLY167和GLY168。計算之后的結(jié)果如圖3所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)ACOT1體系中,2個Loop區(qū)域之間的距離在模擬初始階段距離在5A左右,隨著模擬時間的延長,2個Loop區(qū)域之間的距離逐漸縮小,當模擬達到穩(wěn)定狀態(tài)時,它們之間的距離維持在3A左右,表明它們之間已經(jīng)靠疏水相互作用達到了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定狀態(tài)。在ACOT1＿MULT體系中,從模擬開始時2個Loop當模擬達到穩(wěn)定狀態(tài)時,2個Loop之間的距離已經(jīng)超過了7A,說明它們之間的相對位置發(fā)生了很大的變化,由此可得出它們之間已經(jīng)不存在疏水的相互作用。3.5外在結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)變化為了更加直觀的觀察分子動力學過程中2個體系的變化情況,研究中分別提取出了2個體系在分子動力學模擬中最后2ns內(nèi)的穩(wěn)定的構(gòu)象進行分析,并將提取出的穩(wěn)定時的構(gòu)象與模擬初始時的構(gòu)象進行對比,觀察活性中心以及活性中心附近的Loop區(qū)域以及殘基的變化情況,具體的對比后的結(jié)果如下圖(圖4)所示,從圖中可以看出,在ACOT1體系中(圖4(a)和圖4(b)),突變殘基ALA189THR附近的Loop區(qū)域以及活性中心附近的“蓋子”區(qū)域(圖4(a)中畫線部分)相互靠近,使得2個Loop區(qū)域之間的距離逐漸縮小,起到了很好的保護內(nèi)部的活性中心的作用。活性中心內(nèi)部的三聯(lián)體氨基酸(SER232,ASP326和HIS360)在動力學過程中相對于初始結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生太大的變化。為了更加形象的展示活性中心附近的“蓋子”區(qū)域的變化,用表面化的方式展示了整個蛋白的結(jié)構(gòu)(圖4(b)),從圖中可以發(fā)現(xiàn),活性中心附近的2個Loop區(qū)域已經(jīng)穩(wěn)定的結(jié)合在了一起,形成了一個類似于“橋”狀的結(jié)構(gòu),活性中心的三聯(lián)體氨基酸位于“橋”的下面,這個結(jié)構(gòu)的形成更有利于在活性中心周圍形成一個疏水性“蓋子”,使得配體或抑制劑分子穩(wěn)定的結(jié)合在活性中心的內(nèi)部。在ACOT1＿MULT體系中,由于殘基ALA189突變成了帶有極性的羥基基團的THR,從上面氫鍵的分析過程中可以發(fā)現(xiàn),突變位點與相鄰的Loop區(qū)域內(nèi)的氨基酸形成了新的氫鍵,使得此Loop區(qū)域朝著突變位點所在的第4個β折疊的末端Loop區(qū)域拉伸(圖4(c)中右下方的畫線部分),對應的活性口袋上面的“蓋子”區(qū)域也在分子動力學過程中發(fā)生了很大的偏移(圖4(c)中右上方的畫線部分),從圖4(c)中可以發(fā)現(xiàn),分子動力學過程中活性中心的催化三聯(lián)體氨基酸的相對位置并沒有發(fā)生明顯的變化。將突變后的ACOT1＿MULT體系分子動力學的穩(wěn)定構(gòu)象通過表面化的方式顯示后的結(jié)果(圖4(d))發(fā)現(xiàn),活性中心上方的“蓋子”區(qū)域在動力學過程中丟失,蛋白的活性中心暴露在親水性的環(huán)境中。由此可以發(fā)現(xiàn),突變后新的氫鍵的形成不僅影響到了與其相鄰的Loop區(qū)域的變化,同時也間接的影響到了活性中心上面的“蓋子”區(qū)域的變化。4gly139突變本研究用分子動力學模擬的方法研究了氨基酸突變對蛋白結(jié)構(gòu)造成的影響。通過氫鍵及疏水作用的分析發(fā)現(xiàn)氨基酸突變后蛋白活性中心的“蓋子”區(qū)域丟失,致使蛋白的活性中心暴露在親水的環(huán)境中,改變了活性中心周圍的結(jié)構(gòu),同時也影響了活性中心和