中空纖維膜液相微萃取-高效液相色譜法測定醋酸氯己定趾栓中醋酸氯己定的含量

中空纖維膜液相微萃取-高效液相色譜法測定醋酸氯己定趾栓中醋酸氯己定的含量

作為一種消毒消毒劑，醋酸氯仿對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌的抗菌和殺菌能力較強(qiáng)。近年來，它的用途日益擴(kuò)大。醋酸氯己定痔瘡栓主藥成分為醋酸氯己定,輔料為半合成的脂肪酸酯。臨床用于內(nèi)痔、外痔等肛腸疾病及手術(shù)前后的消毒和預(yù)防感染。醋酸氯己定的含量為該栓劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)?，F(xiàn)有的醋酸氯己定含量測定方法主要有紫外分光光度法、導(dǎo)數(shù)分光光度法和高效液相色譜法(HPLC)。采用上述方法時(shí),樣品需要先用環(huán)己烷或乙醚萃取,然后用醋酸溶液再反萃取,步驟多,操作麻煩,容易造成樣品損失,而且使用乙醚和環(huán)己烷會(huì)對環(huán)境造成污染。近年來,液相微萃取作為一種新的樣品預(yù)處理方法用于環(huán)境復(fù)雜樣品的分析。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于:1.所需有機(jī)溶劑用量少(一般為1~40μL),可大大提高萃取時(shí)的傳質(zhì)速度,從而縮短萃取時(shí)間。2.萃取后,樣品萃取液可直接取出,無需靜置分離,簡化了樣品處理的步驟。3.易于實(shí)現(xiàn)樣品的純化和富集,并且降低了干擾,提高了分析靈敏度。但該方法有以下缺點(diǎn):1.將萃取液直接加到樣品溶液中,在萃取過程中不能劇烈攪拌,萃取靠樣品擴(kuò)散進(jìn)行,因而萃取速度較慢。2.萃取溶液易于揮發(fā),因此萃取時(shí)間不能長,萃取往往達(dá)不到平衡,導(dǎo)致靈敏度提高不多。另外,萃取在非平衡狀態(tài)下進(jìn)行,使得萃取過程難于控制,重復(fù)性不佳。Ma等和張朝輝等采用液-液-液三相微萃取,解決了微萃取溶劑與毛細(xì)管電泳和HPLC流動(dòng)相兼容問題,但是該方法增加了萃取步驟,操作復(fù)雜,同樣是將萃取劑直接加到中間相溶液中,萃取也是在非平衡狀態(tài)下進(jìn)行,因而靈敏度增加也不多。Pedersen-Bjergaard等采用中空纖維膜液相微萃取的新方法,首先將萃取液裝在中空纖維膜中,然后將裝有萃取液的中空纖維膜置于樣品溶液中進(jìn)行萃取。該方法允許劇烈攪拌,從而提高了傳質(zhì)速度;還可以有效地防止萃取劑的揮發(fā);確保液相微萃取在平衡條件下進(jìn)行,因此該法既具有液相微萃取的優(yōu)點(diǎn),又克服了它的缺點(diǎn)。本文采用中空纖維膜液相微萃取技術(shù)處理樣品,應(yīng)用高效液相色譜測定醋酸氯己定痔瘡栓中醋酸氯己定的含量,測定結(jié)果與藥品所示含量一致,與未經(jīng)液相微萃取的高效液相色譜方法相比靈敏度提高了約24倍。1氧指數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)勢法液相微萃取原理(裝置如圖1)與液液萃取原理相同,組分在水相和有機(jī)相之間的平衡是熱力學(xué)平衡,當(dāng)萃取達(dá)到平衡時(shí),組分在水相和有機(jī)相中的化學(xué)勢相等,即有μw=μo,因μw=μθw+RTln(cwcθ),μo=μθo+RTln(cocθ)μw=μwθ+RΤln(cwcθ),μo=μoθ+RΤln(cocθ),故ln(cocw)=(μθw?μθo)/(RT)ln(cocw)=(μwθ-μoθ)/(RΤ)。在一定的溫度、壓力下,μθw,μθo為常數(shù),故cocw=Pcocw=Ρ亦為常數(shù)。上述公式中,μw,μθw,μo,μθo分別為待測物在水相和有機(jī)相的化學(xué)勢及標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)勢;P為分配系數(shù);co為有機(jī)相中組分的濃度;cw為水相中組分的濃度。當(dāng)萃取達(dá)到平衡時(shí),co就是水相中藥物濃度(cw)的P倍。在液相微萃取中,因?yàn)橛袡C(jī)相與水相的體積比很小,萃取過程中水相中組分的濃度變化不大,從而使組分得到分離與富集。2實(shí)驗(yàn)部分2.1材料、儀器和膜高效液相色譜儀包括Constametric4100泵,Waters486檢測器,ChromPerfect數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)。S21-2恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)。聚丙烯中空纖維膜(內(nèi)徑1mm,壁厚70μm,膜孔徑0.45μm,膜孔率70%,天津大學(xué)化工學(xué)院膜研究所)。醋酸氯己定標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所),醋酸氯己定痔瘡栓(黑龍江天龍藥業(yè)有限公司),正辛醇(分析純,天津市博迪化工有限公司),乙腈(色譜純,康科德試劑有限公司)。磷酸、三乙胺、醋酸、醋酸鈉(均為分析純)。試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。2.2流動(dòng)相色譜柱為WatersSymmetryC18柱(150mm×3.9mmi.d.,5μm);流動(dòng)相為乙腈-水(體積比為29∶71,含三乙胺0.3%,pH3(磷酸調(diào)節(jié))),流速為1mL/min;進(jìn)樣量為10μL;檢測波長為260nm。2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取醋酸氯己定標(biāo)準(zhǔn)品50mg,溶于100mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得到質(zhì)量濃度為0.5g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.4醋酸提取方法取1粒樣品,精密稱定,溫?zé)崾蛊淙诨?混勻后冷卻,加1.5mol/L的醋酸溶液提取5次(分別用20,20,15,15,10mL醋酸溶液),合并提取液,置于100mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。2.5纖維復(fù)合膜的制備將中空纖維膜截成長約8cm的小段,用甲醇洗3次以除去中空纖維膜表面的雜質(zhì),干燥除去殘余甲醇。在中空纖維膜小段中加入30μL的正辛醇。用大約70℃的鑷子用力夾中空纖維膜小段的兩端將兩端封死。在一個(gè)8mL的瓶中加入適量的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液、適量的樣品溶液和水,使最后體積為7mL。在25℃和常壓下,將裝有正辛醇的中空纖維膜小段置于該溶液中,啟動(dòng)電磁攪拌器,攪拌速度保持為600r/min,萃取20min后將裝有正辛醇的中空纖維膜小段取出,剪開小段的一端,從中取10μL萃取液用于高效液相色譜進(jìn)行分析。3結(jié)果與討論3.1ph值對醋酸氯己定峰面積的影響考察了緩沖液pH值為3.6~8.0時(shí)對萃取效果的影響,緩沖液組成為0.2mol/L醋酸/醋酸鈉緩沖液和0.2mol/L磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖液。從圖2可以看出,緩沖液pH值為3.6~4.6時(shí),醋酸氯己定的峰面積隨pH的增加而增加得很快;pH值為4.6~5.0時(shí),其峰面積隨pH的增加而增加,但增加幅度比較小;pH值大于5.0時(shí),峰面積隨pH的增加而降低;峰面積在pH為5.0時(shí)最大。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因在于:pH小于5.0時(shí),醋酸氯己定分子中的氨基與氫離子結(jié)合,主要以銨鹽的形式存在,醋酸氯己定在水溶液中的溶解度增大,在正辛醇相中的濃度降低;pH大于5.0時(shí),醋酸氯己定分子中的醋酸主要以醋酸根的形式存在,醋酸氯己定在水溶液中的溶解度增大,在正辛醇相中的濃度降低;pH=5.0時(shí),醋酸氯己定主要是以分子的形式存在,在水溶液中的溶解度小,在正辛醇相中的濃度最大。本實(shí)驗(yàn)選取的緩沖液為0.2mol/L醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH5.0)。3.2萃取時(shí)間對組分粒徑的影響待測組分在兩相中達(dá)到分配平衡需要一定的時(shí)間,本文考察了液相微萃取達(dá)到平衡的時(shí)間。在電磁攪拌速度為600r/min下,在15min之前,待測組分在正辛醇相中的濃度隨萃取時(shí)間的增加而增加;在15min之后,待測組分在兩相中達(dá)到平衡(見圖3)。為了確保每一次測定都是在萃取平衡的條件下進(jìn)行,本實(shí)驗(yàn)選取的萃取時(shí)間為20min。3.3醋酸氯己定標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備在6.76mL醋酸/醋酸鈉緩沖液(pH5.0)中加入224μL質(zhì)量濃度為16mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密取10μL進(jìn)樣,記錄醋酸氯己定的色譜峰(見圖4-a)。在該溶液中放入裝有30μL正辛醇的中空纖維膜,萃取20min后,精密取10μL進(jìn)樣,記錄醋酸氯己定的色譜峰(圖4-b)。圖4-b中醋酸氯己定的峰面積為3345271,圖3-a中醋酸氯己定的峰面積為135678,前者的峰面積為后者峰面積的24.6倍。3.4纖維復(fù)合膜的制備精密量取7,10,14,28,56,112,168,224μL對照品溶液,加入適量的pH5.0的0.2mol/L醋酸/醋酸鈉緩沖液,使體積達(dá)到7mL,制備成質(zhì)量濃度為0.50,0.71,1.0,2.0,4.0,8.0,12.0,16.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在中空纖維膜中加入30μL的正辛醇,萃取20min后,取10μL萃取液進(jìn)樣分析。以峰面積Y為縱坐標(biāo),以水相中藥物的質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo),得回歸方程為Y=210791X-27626.1(r2=0.9998),表明醋酸氯己定在0.50~16.0mg/L范圍內(nèi)與其峰面積具有良好線性關(guān)系。3.5中空纖維膜的制備分別取224μL樣品溶液,依次加入6個(gè)裝有6.76mL醋酸緩沖液(0.2mol/L,pH5.0)的小瓶中,分別放入裝有30μL正辛醇的中空纖維膜。萃取20min后,分別取萃取液10μL進(jìn)樣,記錄醋酸氯己定的峰面積,6次測定峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%。3.6醋酸氯己定標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別取224μL已知含量的樣品溶液,置于裝有6.76mL醋酸緩沖液(0.2mol/L,pH5)的小瓶中,依次加入14,28,42μL醋酸氯己定標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按本文實(shí)驗(yàn)方法測定醋酸氯己定的含量,計(jì)算回收率,結(jié)果見