花生殼膳食纖維低密度脂蛋白吸附劑的制備及性能研究

花生殼膳食纖維低密度脂蛋白吸附劑的制備及性能研究

1采用現(xiàn)用的治療方法隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活水平不斷提高，發(fā)病率高、脂肪性、肺動(dòng)脈硬化的發(fā)病率也在增加，這嚴(yán)重危害了人類健康。臨床醫(yī)學(xué)表明，低密度脂肪酸（ldl）對(duì)膽固醇的運(yùn)輸起著重要作用，這與膽固醇代謝和動(dòng)脈硬化之間的關(guān)系最大。目前使用藥物療法和飲食療法對(duì)該病的治療效果均不十分滿意,而采用血液灌流方法,通過(guò)吸附劑選擇性地去除血液中的低密度脂蛋白膽固醇來(lái)治療高脂血癥,是一種行之有效的、有很好前景的方法。傳統(tǒng)LDL吸附劑所選用的載體多種多樣,所采用的配基也較多。膳食纖維由于價(jià)廉、良好的反應(yīng)性及可再生性,被廣泛用于吸附劑載體材料。膳食纖維分子鏈上大量的羥基,使膳食纖維具有優(yōu)良的親水性和化學(xué)反應(yīng)性。膳食纖維通過(guò)羥基的功能基化反應(yīng),可以鍵連各種配基。且膳食纖維生物相容性良好,因此以膳食纖維為載體制成不同種膳食纖維衍生物,可進(jìn)行血液中的膽固醇吸附。本實(shí)驗(yàn)制備出一種新型雙親型低密度脂蛋白吸附劑,該吸附劑同時(shí)利用疏水作用和靜電作用對(duì)血漿中的膽固醇脂蛋白進(jìn)行吸附,可有效降低血漿中膽固醇含量,是一種新型的高效低密度脂蛋白吸附劑。2豬血漿中co和ldl-c含量的檢測(cè)2.1合成基本原理(見(jiàn)下頁(yè)化學(xué)反應(yīng)式)2.2試劑與儀器(1)主要試劑:花生殼膳食纖維,由本實(shí)驗(yàn)室自制;環(huán)氧氯丙烷(分析純),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;十二胺(分析純),飛翔化工有限公司;氯磺酸(分析純),上海亭新化工廠?；瘜W(xué)反應(yīng)式(2)主要儀器:721分光光度計(jì),上海第三分析儀器廠;HH-2A恒溫水浴鍋,金壇市宏華儀器廠。2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1花生殼膳食纖維的活化將20g花生殼膳食纖維放入三口燒瓶中,加入100ml的環(huán)氧氯丙烷和3mol/L的NaOH溶液400ml,40℃水浴下反應(yīng)2.5h。將產(chǎn)品用無(wú)水乙醇和去離子水反復(fù)洗滌至中性,抽濾得活化產(chǎn)品。2.3.2活化膳食纖維的胺化20g已活化膳食纖維(濕態(tài))放入三口燒瓶中,加入30ml去離子水,然后加入20ml十二胺。將三口燒瓶放入70℃的恒溫水浴鍋中,在攪拌條件下,胺化反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后,冷卻、抽濾,并用乙醇和去離子水充分洗滌至中性。即得胺化膳食纖維產(chǎn)品。2.3.3磺化試劑的制備以甲酰胺為反應(yīng)介質(zhì),制備氯磺酸-甲酰胺磺化試劑。將100ml甲酰胺放入三口燒瓶中,置于冰鹽浴下。在攪拌條件下,滴加30ml的氯磺酸?？刂坡然撬岬牡渭铀俣?使反應(yīng)體系的溫度保持在5℃以下。滴加完畢后,得到白色黏稠液體,供磺化使用。2.3.4胺化膳食纖維的磺化將上述含磺化試劑的三口燒瓶放入60℃的恒溫水浴鍋中,加入10g胺化后的膳食纖維,在攪拌條件下進(jìn)行磺化反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間為3h。反應(yīng)結(jié)束后,向反應(yīng)體系中加入適量去離子水,使充分溶解。將所得產(chǎn)品抽濾,充分洗滌至中性,即得最終產(chǎn)品。2.4吸附實(shí)驗(yàn)取少量新鮮豬血于離心試管中,3000r/min離心10min,抽取血漿,備用。吸附劑先用0.9%的生理鹽水充分浸泡24h溶脹后,用濾紙吸干其表面水分,溶脹度為16.5%。溶脹度=(Mw-Md)/Md式中:Mw為溶脹后濕態(tài)的質(zhì)量;Md為溶脹前干態(tài)的質(zhì)量。采用靜態(tài)吸附法。稱取一定量的吸附劑于三角燒瓶中,加入5ml豬血漿,于37℃下恒溫振蕩2.5h,離心分離,取上清液進(jìn)行測(cè)定。用生化實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定吸附前后豬血漿中的TC、HDL-C和LDL-C的含量,LDL-C=TC-(HDL-C)。吸附率(A)由下式計(jì)算:A%=C0?C1C0×100%A%=C0-C1C0×100%式中:A為吸附率;C為血漿中TC,HDL-C、LDL-C的濃度;Co為吸附前濃度;C1為吸附后濃度。3結(jié)果與討論3.1反應(yīng)條件的確定3.1.1反應(yīng)時(shí)間及溫度當(dāng)固定反應(yīng)溫度為40℃,反應(yīng)時(shí)間為2h時(shí),測(cè)定產(chǎn)品環(huán)氧值含量。NaOH濃度對(duì)環(huán)氧值含量的影響,如圖1(a)所示;當(dāng)NaOH濃度大于3mol/L,環(huán)氧值含量隨NaOH濃度的升高而降低。因此,NaOH濃度可選為3mol/L。當(dāng)固定反應(yīng)時(shí)間為2h,NaOH濃度為3mol/L時(shí),當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到40℃,環(huán)氧值含量基本穩(wěn)定(見(jiàn)圖1(b))。當(dāng)固定反應(yīng)溫度為40℃,NaOH濃度為3mol/L,反應(yīng)時(shí)間大于2.5h時(shí),環(huán)氧值含量隨時(shí)間的增大而減小(見(jiàn)圖1c))。因此,反應(yīng)時(shí)間確定為2.5h。3.1.2二胺用量對(duì)各合成纖維平均總膽固醇的吸附率的影響當(dāng)固定反應(yīng)溫度為60℃,反應(yīng)時(shí)間為4h,膳食纖維用量與十二胺用量比值(g/ml)為1∶1時(shí),對(duì)3個(gè)血漿樣本的平均總膽固醇吸附率達(dá)到最大,如表1所示。當(dāng)固定十二胺用量,反應(yīng)時(shí)間為4h,反應(yīng)溫度達(dá)到70℃時(shí),對(duì)3個(gè)血漿樣本的平均總膽固醇吸附率達(dá)到最高,如圖2(a)所示。當(dāng)固定十二胺用量,反應(yīng)溫度為70℃,反應(yīng)時(shí)間為4h時(shí),對(duì)3個(gè)血漿樣本的平均總膽固醇吸附率達(dá)到最大,如圖2(b)所示。因此,在溫度為70℃,反應(yīng)時(shí)間為4h,膳食纖維和十二胺用量(g/ml)比值為1∶1時(shí),所得胺化膳食纖維的紅外光譜圖顯示(見(jiàn)圖3a),在波數(shù)3450cm-1處有強(qiáng)吸收峰,表明有-OH基團(tuán)的O-H鍵和-NH-基團(tuán)的N-H鍵伸縮振動(dòng);在2960cm-1處有中強(qiáng)吸收,表明有-CH2或-CH3基團(tuán)的C-H伸縮振動(dòng);在2880cm-1處有中強(qiáng)吸收,表明有-CH2基團(tuán)的C-H鍵伸縮振動(dòng);在1662cm-1處有強(qiáng)吸收,表明有-NHCOCH基團(tuán)的C=O鍵的伸縮振動(dòng)、非對(duì)稱伸縮振動(dòng)和N-H鍵的彎曲振動(dòng);在1071cm-1處有強(qiáng)吸收,表明有C-O的伸縮振動(dòng)和C-N的伸縮振動(dòng)。3.1.3親水性膳食纖維的磺化反應(yīng)固定甲酰胺(10ml)及胺化膳食纖維(1g)用量,選取氯磺酸的用量(Vch)、反應(yīng)溫度(Reactiontemperature)、反應(yīng)時(shí)間(Reactiontime)三個(gè)因素,做正交實(shí)驗(yàn),測(cè)定產(chǎn)物對(duì)3個(gè)血漿樣本的平均總膽固醇吸附率,結(jié)果如表2所示。由表2可知,各影響因素中,氯磺酸用量影響最大,反應(yīng)溫度次之,反應(yīng)時(shí)間的影響因素最小。1g胺化膳食纖維的磺化,固定甲酰胺用量10ml,最佳磺化條件是A1B1C1,即氯磺酸用量3ml,反應(yīng)溫度60℃,反應(yīng)時(shí)間3h,得到雙親型膳食纖維吸附劑。其紅外光譜圖如圖3(b)所示。由雙親型膳食纖維吸附劑的紅外光譜可以看出,在波數(shù)3460cm-1處有強(qiáng)吸收峰,顯示有-OH基團(tuán)的O-H鍵和-NH-基團(tuán)的N-H鍵伸縮振動(dòng);在2940cm-1處有中強(qiáng)吸收,顯示有-CH2或-CH3基團(tuán)的C-H伸縮振動(dòng);在1730cm-1處有強(qiáng)吸收,顯示有-NHCOCH基團(tuán)的C=O鍵的伸縮振動(dòng)、非對(duì)稱伸縮振動(dòng)和N-H鍵的彎曲振動(dòng);在1170cm-1處有中強(qiáng)吸收,表明有SO32-基團(tuán)的S=O鍵伸縮振動(dòng);在1060cm-1處有強(qiáng)吸收,顯示有C-O的伸縮振動(dòng)和C-N的伸縮振動(dòng)。在831cm-1指紋區(qū)有吸收,表明有C-O-S鍵的伸縮振動(dòng)。3.2血漿tc、hdl-c含量分別稱取0.05、0.1、0.15、0.2、0.3g吸附劑于三角燒瓶中,加入5ml的血漿,于38.5℃下恒溫振蕩2.5h,離心分離,取上清液測(cè)定吸附前后血漿中的TC、HDL-C的含量。對(duì)5個(gè)血漿樣本進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn),吸附結(jié)果如表3所示。由表3可知,當(dāng)雙親型吸附劑用量0.15g,血漿用量5ml時(shí),其對(duì)TC和LDL-C的平均吸附率分別可達(dá)到49.9%和61.5%,而對(duì)HDL-C的吸附率為25.2%,表現(xiàn)出良好的選擇性。3.3低密度脂質(zhì)體吸附劑吸附機(jī)制稱取0.15g吸附劑于三角燒瓶中,加入5ml血漿,于38.5℃下恒溫振蕩2.5h,離心分離,取上清液測(cè)定吸附前后血漿中的TC、HDL-C的含量。對(duì)17個(gè)血漿樣本進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn),吸附結(jié)果如表4所示。目前,以纖維素為載體的低密度脂蛋白吸附劑,主要以膽固醇、氨基酸和磺酸基團(tuán)為配基,對(duì)低密度脂蛋白的吸附率達(dá)到56%。由表4可知,本實(shí)驗(yàn)研制的雙親型吸附劑對(duì)TC平均吸附率為40.8%,LDL-C平均吸附率為50.8%,HDL-C的平均吸附率為23.6%;具有良好的選擇性。由于雙親型膳食纖維吸附劑同時(shí)具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán),利用十二胺的碳鏈?zhǔn)杷饔煤突撬峄鶊F(tuán)的靜電作用,可對(duì)血漿中的膽固醇脂蛋白進(jìn)行吸附,對(duì)TC與LDL-C均有很高的吸附率,可顯著降低血漿TC和LDL-C水平。因?yàn)長(zhǎng)DL與HDL表面堿性氨基酸殘基的差異,二者帶電量也有明顯不同。同HDL相比,LDL表面帶有大量正電荷基團(tuán)。根