三唑類殺菌劑戊唑醇對赤霉病菌fusariumgra-mdna侵染小麥穗部過程的影響

三唑類殺菌劑戊唑醇對赤霉病菌fusariumgra-mdna侵染小麥穗部過程的影響

各種耕作桿菌感染的小麥穗部的紅霉病是小麥生產(chǎn)的主要疾病和主要防治對象，在世界上廣泛發(fā)生，尤其是在炎熱和半濕地區(qū)。發(fā)生在我國的赤霉病主要由禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum引起,病菌主要在小麥開花期侵入危害。由于目前尚無高抗赤霉病的小麥品種,在赤霉病多發(fā)區(qū)采用化學(xué)藥劑防治仍是必不可少的措施。國外及本實驗室的田間試驗結(jié)果表明,戊唑醇是目前防治小麥赤霉病最有效的藥劑,它不僅能降低田間小麥赤霉病的嚴(yán)重度,同時能夠降低籽粒中毒素的含量,但是關(guān)于戊唑醇防治小麥赤霉病的作用機(jī)理目前還不十分清楚。為進(jìn)一步闡明戊唑醇的防病機(jī)理,筆者通過電鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)研究了戊唑醇在小麥赤霉病菌侵染小麥的過程中,對病菌形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和產(chǎn)毒變化的影響。1材料和方法1.1小麥種子及其接種供試菌種為禾谷鐮刀菌F.graminearum強(qiáng)致病菌株,由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理研究所提供,采用麥粒培養(yǎng)基擴(kuò)大繁殖,獲得大量的大型分生孢子。供試小麥品種為小偃22號,該品種對小麥赤霉菌高度感染。2000年和2001年10月中旬分別將小麥種子播于直徑30cm的花盆內(nèi),待翌年小麥揚(yáng)花時用于接種試驗。接種前,用蒸餾水沖洗麥粒培養(yǎng)基得到分生孢子,配制成濃度為5×10個/mL的孢子懸浮液。在小麥揚(yáng)花盛期,用移液器將分生孢子懸浮液滴入外稃與內(nèi)稃之間,每小花10μL,然后用塑料袋封住接種穗保濕1天。1.2谷子谷e供試藥劑為25%的戊唑醇(tebuconazole)乳油(德國拜耳公司產(chǎn)品)。按1.25mL/L的濃度分別于接種前2天、接種后2天和4天用噴霧器噴霧處理,對照處理噴清水。1.3取樣時間接種前2天施藥的處理,分別于接種后12h、1、2和3天取樣;接種后2天和4天施藥處理,分別于施藥后2、4和6天取樣。取樣時將整個小花,包括外稃、內(nèi)稃、子房和小穗軸全部取下,放在4%(v/v)戊二醛磷酸緩沖液(100mmol/L,pH6.8),4℃下固定20h,相同的緩沖液沖洗,經(jīng)系列丙酮脫水、CO2臨界點干燥、粘樣、鍍膜后,在Zeiss100型掃描電鏡(15KV)下觀察、拍照。1.4醇脫水、lr-w樹脂的聚合接種前2天施藥處理,于接種后1、2、4天取樣;接種后2天和4天施藥處理,分別于施藥后2、3、4和6天取樣,取樣時將接種小花取下,用小刀將外稃、內(nèi)稃、子房和小穗軸切成小塊,置入4%(v/v)戊二醛磷酸緩沖液(100mmol/L,pH6.8),于4℃下固定10～20h,經(jīng)相同的緩沖液沖洗后,再放入1%鋨酸(OsO4,10g/L),于4℃下固定2h。用系列乙醇脫水、LR-white樹脂包埋,于50℃下聚合48h。將聚合后的樣品用鉆石刀切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后,在Zeiss-EM10電子顯微鏡(80kV)下觀察、拍照。1.5毒素免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記毒素免疫金標(biāo)記樣品的加工制備及標(biāo)記參照Kang等的方法。2結(jié)果與分析2.1病原菌從受侵后的副產(chǎn)物中擴(kuò)展原理表3掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),人工接種后6～12h,位于外稃內(nèi)表面、內(nèi)稃及子房上的病菌分生孢子多數(shù)已經(jīng)萌發(fā),每個孢子可產(chǎn)生1至多個芽管(圖1-1),新產(chǎn)生的芽管并未侵入寄主組織,而是在寄主體表繼續(xù)生長擴(kuò)展。接種后24h左右觀察,菌絲分支增多,菌落迅速擴(kuò)大,到接種后36～48h,在外稃內(nèi)表面、內(nèi)稃及子房的表面已經(jīng)形成密集的網(wǎng)狀菌落(圖1-2),并且已經(jīng)以侵染菌絲的形式從子房、內(nèi)稃的表面和外稃的內(nèi)表面侵入寄主組織。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),接種后2天,病菌已侵入寄主組織,此時菌絲僅以胞間生長的方式在寄主組織內(nèi)擴(kuò)展。隨著菌絲的生長擴(kuò)展,寄主細(xì)胞也發(fā)生一系列的異常變化,如細(xì)胞的塌陷、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的解體等(圖1-3)。隨后,菌絲同時以胞間和胞內(nèi)生長的方式向下擴(kuò)展,接種后4～5天,菌絲已經(jīng)從受侵的子房、內(nèi)稃、外稃向下擴(kuò)展到達(dá)穗軸,并在穗軸內(nèi)以胞間和胞內(nèi)生長方式,沿皮層組織和維管束組織向上向下擴(kuò)展(圖14,5),延伸到相鄰的小花。隨菌絲在小麥穗部組織中的不斷生長、擴(kuò)展,使得寄主細(xì)胞壞死、解體,并最終導(dǎo)致整個麥穗的枯死。2.2外、頂格情況接種前2天噴藥,接種后12h取樣觀察,未見有孢子萌發(fā);接種后1天觀察,在小穗的外稃內(nèi)表面、內(nèi)稃及子房表面可觀察到分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管,但芽管和菌絲畸形、腫脹,菌絲分枝增多、頂端顯著膨大呈圓球狀,表明菌絲的生長發(fā)育明顯受到抑制(圖2-1)。接種后3天觀察,菌絲的分枝較1天時增加很多,但菌絲都很短,沒有觀察到菌絲擴(kuò)展形成的網(wǎng)狀菌落和侵染菌絲(圖2-2)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),外表畸形的菌絲細(xì)胞壁增厚,細(xì)胞質(zhì)電子致密度增加,產(chǎn)生非膜結(jié)構(gòu)的內(nèi)含體(圖3-1)。在接種后不同的時期取樣進(jìn)行電鏡觀察,均未觀察到畸形菌絲產(chǎn)生入侵結(jié)構(gòu),而且未發(fā)現(xiàn)外稃、內(nèi)稃及子房組織內(nèi)有菌絲。與對照相比,表明戊唑醇不但可以延遲病菌孢子萌發(fā),而且可以引起芽管和菌絲畸形,抑制菌絲擴(kuò)展,最終完全抑制病菌對寄主組織的侵染。2.3內(nèi)體及其內(nèi)體菌落生長的觀察人工接種后2天噴藥,并于施藥后不同的時期取樣,掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),位于寄主體表的菌絲分枝增多,并不規(guī)則膨大,特別是菌絲頂端更為明顯,嚴(yán)重時菌絲塌陷、壞死(圖2-3,4)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),寄主組織內(nèi)的病菌菌絲超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了一系列變化,表現(xiàn)為菌絲細(xì)胞的細(xì)胞壁不規(guī)則增厚,特別是菌絲的頂端部位增厚更加明顯;與細(xì)胞壁相似,隔膜也呈現(xiàn)不規(guī)則加厚,加厚部位電子致密物增加(圖3-2,3);菌絲細(xì)胞質(zhì)電子致密度加深,液泡數(shù)量增加,細(xì)胞器解體、壞死(圖3-2);一些非膜結(jié)構(gòu)、電子透明的內(nèi)含體常常在菌絲細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)(圖3-4),而且這些內(nèi)含體不規(guī)則地分布在菌絲細(xì)胞質(zhì)中,而對照菌絲中未觀察到這些內(nèi)含體。此外,還發(fā)現(xiàn)在即將壞死的菌絲細(xì)胞內(nèi)有新的菌絲(子菌絲)形成,而且子菌絲也呈不正常狀態(tài),如細(xì)胞壁不規(guī)則的加厚,細(xì)胞質(zhì)壞死等(圖3-5),寄主組織內(nèi)的病菌菌絲生長因受到抑制而不能擴(kuò)展到穗軸部位。接種后4天,菌絲已侵入到穗軸組織中,噴藥后取樣觀察,菌絲生長明顯受到抑制,不再向上、向下擴(kuò)展、延伸到相鄰的小穗。同時菌絲的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了同上述相同的變化,如細(xì)胞壁的不規(guī)則加厚,特別是菌絲的頂端部位增厚更加明顯,加厚部位電子致密物增加,細(xì)胞質(zhì)電子致密度加深,液泡增多,細(xì)胞器排列紊亂等(圖4-1)。2.4細(xì)菌細(xì)胞中毒素的分布超薄切片經(jīng)DON抗血清和山羊抗兔免疫球蛋白-膠體金孵育后,在殺菌劑處理與未處理的寄主和菌絲細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有毒素的存在。毒素主要分布在寄主細(xì)胞的細(xì)胞壁、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和液泡中;菌絲細(xì)胞中毒素主要分布在菌絲細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和液泡中(圖4-2,3),但是毒素標(biāo)記的密度在殺菌劑處理與未處理的寄主及菌絲細(xì)胞中有明顯的差異。殺菌劑處理后,不論是寄主細(xì)胞還是菌絲細(xì)胞,毒素的標(biāo)記密度明顯小于未處理對照。特異性對照試驗表明,不論是DON抗血清提前用DON抗原處理,還是僅用第二抗體處理,寄主組織和菌絲細(xì)胞中都未出現(xiàn)標(biāo)記的顆粒(圖4-4)。3對分生孢子萌發(fā)的影響本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),戊唑醇對赤霉菌侵染小麥的過程有顯著的影響,無論是接種前2天施藥,還是接種后2天、4天施藥,都可抑制病菌的進(jìn)一步擴(kuò)展,同時能減少病原菌和寄主組織中毒素的含量。病菌形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的變化主要表現(xiàn)為菌絲腫脹、過度分枝、液泡增加、細(xì)胞壁不規(guī)則加厚和細(xì)胞質(zhì)的壞死和降解。這些變化與脫甲基抑制劑(DMIs)對其它植物病原菌的影響相似[6～9]。本試驗結(jié)果為戊唑醇在田間有效地防治小麥赤霉病提供了毒理學(xué)依據(jù)。前人的研究認(rèn)為DMIs能夠改變病原菌的形態(tài),導(dǎo)致畸形生長。使芽殖真菌細(xì)胞腫大,相互連接呈鏈狀和簇狀;而使絲狀真菌菌絲過度分枝,畸形腫脹,有時菌絲頂端破裂,這些形態(tài)的改變是由于菌絲細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化引起的。本試驗中戊唑醇對孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲的影響與前人研究的結(jié)果一致,戊唑醇是三唑類殺菌劑,和其它三唑類殺菌劑一樣,是通過抑制麥角甾醇的生物合成來阻止病原菌的生長。甾醇是真核生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的重要組成物質(zhì),它在調(diào)節(jié)真菌細(xì)胞膜的滲透性方面起著重要的作用,高水平的甾醇減少膜的滲透性,低水平的甾醇增加膜的滲透性。麥角甾醇的合成受到抑制后,使其在膜內(nèi)的含量減少,導(dǎo)致膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,同時改變了與膜結(jié)合的酶的活性,特別是幾丁質(zhì)合成酶的活性,而幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要組成成份,幾丁質(zhì)合成酶活性的改變,使細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,最終導(dǎo)致病原菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列的變化。從本試驗的結(jié)果可以看出,戊唑醇對小麥赤霉菌分生孢子的萌發(fā)有一定的影響,但不能完全抑制其萌發(fā),主要是對萌發(fā)后產(chǎn)生的芽管和菌絲有強(qiáng)烈的致畸和抑制作用。噴藥時期不同,所表現(xiàn)出的抑制效果也不相同,接種前2天施藥,不能完全阻止分生孢子萌發(fā),但相對的延遲了孢子的萌發(fā),這一結(jié)果與我們室內(nèi)分生孢子萌發(fā)試驗結(jié)果相似,也與Smolka等報道的內(nèi)吸性殺菌劑丙環(huán)唑(propiconazole)對大麥白粉菌Erysiphegraminis侵染大麥過程的影響一致,這些結(jié)果說明病原真菌可以利用孢子中儲存的麥角甾醇。毒素的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記結(jié)果表明,禾谷鐮刀菌在侵染小