維生素A和維生素E的測定方法和維C泡騰片配方工藝

維生素A和維生素E的測定方法（HPLC）

高效液相色譜法最小檢出量分別為VA：0.8ng；α-E：91.8ng；γ-E：36.6ng；δ-E：20.6ng。

1.原理

食物中的維生素A及維生素E經(jīng)皂化提取以后，將其不可皂化的部分提取到有機溶劑中。用HPLC法測定維生素A及維生素E的含量。

2.適用范圍

GB12388-90本法適用于各種食物和飼料的測定

3.儀器

（1）高壓液相色譜儀（帶紫外檢測器）

（2）六孔恒溫水浴鍋

（3）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器

（4）高純氮氣

（5）高速離心機

4.試劑

本實驗所用試劑皆為分析純，所用水皆為蒸餾水

4.1無水乙醇：重蒸，不含有醛類物質(zhì)

檢查方法：取2ml銀氨溶液于試管中，加入少量乙醇，搖勻，再加入10%氫氧化鈉溶液，加熱，放置冷卻后，若有銀鏡反應(yīng)則表示乙醇中有醛。

脫醛方法：取2g硝酸銀溶于少量水中。取4g氫氧化鈉溶于溫乙醇中。將兩者傾入1L乙醇中，振搖后，放置暗處兩天（不時搖動，促進反應(yīng)），經(jīng)過濾，置蒸餾瓶蒸餾，棄去初蒸出的50ml。當(dāng)乙醇中：

4.210%抗壞血酸溶液（Vc）W/V臨用前配制

4.350%氫氧化鉀溶液（KOH）W/V

4.4無水乙醚重蒸，不含過氧化物

4.4.1過氧化物檢查方法：用5ml乙醚加1ml10%碘化鉀溶液，振搖1min，如有過氧化物則放出游離碘，水層呈黃色或加4滴0.5%淀粉液，水層呈藍色。該乙醚需處理后使用。

4.4.2去除過氧化物的方法：重蒸乙醚時，瓶中放入鐵絲或鐵末少許。棄去10%初餾液和10%殘餾液。

4.5pH1-14試紙

4.6無水硫酸鈉Na2SO4

4.7甲醇色譜純或分析純重蒸后使用

4.8重蒸水蒸餾水中加入少量高錳酸鉀重蒸后使用

4.9苯并〔e〕芘標(biāo)準(zhǔn)液稱取苯并〔e〕芘（純度98%），用脫醛乙醇配制成1ml相當(dāng)于5μg苯并〔e〕芘的內(nèi)標(biāo)溶液。

4.10維生素A標(biāo)準(zhǔn)液視黃醇（純度85%Sigma公司）用脫醛乙醇溶解維生素A標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為1ml相當(dāng)于1mg視黃醇。臨用前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。維生素E標(biāo)準(zhǔn)液α-生育酚（純度95%Sigma公司），δ-生育酚（純度95%Sigma公司），δ-生育酚（純度95%Sigma公司）。用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度大約為1ml相當(dāng)于1mg。臨用前用紫外分光光度法分別標(biāo)定此三種維生素E的準(zhǔn)確濃度。

5.操作步驟

本實驗需避光操作

(1)樣品皂化稱取樣品于三角瓶中，加30ml無水乙醇，振搖三角瓶，使樣品分散均勻。加入5ml10%抗壞血酸和苯并〔e〕芘標(biāo)準(zhǔn)液2ml，混勻。最后加入10ml氫氧化鉀邊加邊振搖。于沸水浴上回流30min使樣品皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷卻。

(2)樣品萃取將皂化后的樣品移入分液漏斗中，用50ml水分2次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100ml無水乙醚分兩次洗皂化瓶及殘渣，乙醚液并入分液漏斗中。輕輕振搖分液漏斗2min，靜置分層，棄去水層。然后每次用約100ml水將乙醚液洗至中性，約4-5次。

(3)濃縮將乙醚提取液經(jīng)無水硫酸鈉（約5g）濾入150ml旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)，用約15ml乙醚沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2次，并入蒸發(fā)瓶內(nèi)，并將其接在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，于55℃水浴中減壓蒸餾并回收乙醚，待瓶中乙醚剩下約2ml時，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮氣將乙醚吹干。加入2ml乙醇溶液，充分混合，溶解提取物。將乙醇液移入塑料離心管中，于離心機上以3000轉(zhuǎn)/min離心5分鐘。上清液供色譜分析。

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)品配置成標(biāo)準(zhǔn)溶液（約1mg/ml），制備標(biāo)準(zhǔn)曲線前用紫外分光光度法標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)定方法取維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)液若干微升，分別稀釋至10.00ml乙醇中，并分別按給定波長測定各維生素的吸光值。用比吸光系數(shù)計算該維生素的濃度。測定條件如下

標(biāo)準(zhǔn)比吸光系數(shù)E1%cm波長λ，nm

視黃醇1835325

α—生育酚71294

γ—生育酚92.8298

δ—生育酚91.2298

濃度計算：

X1=A/E×1/100×10.00/S×10-3

式中X1：某維生素濃度，mg/ml；

A：維生素的平均紫外吸光值；

S：加入標(biāo)準(zhǔn)的量，μL；

E：某種維生素1%比吸光系數(shù)；

10.00/S×10-3：標(biāo)準(zhǔn)液稀釋倍數(shù)。

本法采用內(nèi)標(biāo)兩點法進行定量。把一定量的維生素A、維生素E及內(nèi)標(biāo)苯并〔e〕芘液混合均勻，選擇合適的靈敏度，使上述物質(zhì)的各峰高約為滿量程的70%，作為高濃度點，高濃度的1/2為低濃度點（內(nèi)標(biāo)苯并〔e〕芘的濃度值不變），用此二種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)進行色譜分析。根據(jù)微處理機裝置，按說明用二點內(nèi)標(biāo)法進行定量。

液相色譜分析

儀器所需條件

預(yù)柱：ODS10μm，4mm×4.5cm。

分析柱：ODS5μm，4.6mm×25cm。

流動相：甲醇：水=98：2?；靹?，臨用前脫氣。

紫外檢測器波長：300nm。量程0.02。

進樣量：20μL進樣定量環(huán)。

流速：1.65-1.70mL/min。

6.計算

X=C/m×V×100/1000

X：某種維生素的含量，mg/100g；

C：由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到某種維生素含量，μg/mL；

V：樣品濃縮定容體積，mL；

m：樣品質(zhì)量，g；

用微處理機二點內(nèi)標(biāo)法進行計算時，按計算公式計算或由微機直

接給出結(jié)果。

7.注意事項

（1）維生素A極易被破壞，實驗操作應(yīng)在微弱光線下進行，或用棕色玻璃儀器。

（2）在皂化過程中，應(yīng)每5分鐘搖一下皂化瓶，使樣品皂化完全。

（3）提取過程中，振搖不應(yīng)太劇烈，避免溶液乳化而不易分層。

（4）洗滌時，最初水洗輕搖，逐次振搖強度可增加。

（5）無水硫酸鈉如有結(jié)塊，應(yīng)烘干后使用。

（6）在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時，乙醚溶液不應(yīng)蒸干，以免被測樣品含量有損失。

（7）用高純氮吹干時，氮氣不能開的太大，避免樣品吹出瓶外結(jié)果偏低。維C泡騰片生產(chǎn)制作的要求和配方工藝一、維C泡騰片生產(chǎn)車間環(huán)境控制泡騰片在制粒、壓片過程中對生產(chǎn)車間的濕度、溫度要求非常嚴(yán)格也非常重要，一般要求相對濕度在30%以下（建議20％～25％）、溫度在25度以下（建議溫度15～21度）。建議打開空調(diào)和除濕系統(tǒng)，生產(chǎn)過程中必須嚴(yán)格防止水分的吸收，顆粒（如果制粒）與壓片車間要控制空氣的溫濕度，降低相對濕度和控制溫度。如果配方中一定要使用檸檬酸，生產(chǎn)車間的濕度和溫度一定要控制在建議的濕度溫度以內(nèi)，否則很難做到不粘沖。檸檬酸工藝要求太苛刻，可改用酒石酸的，工藝要求會寬松些。潤滑劑選用PEG6000：氯化鈉為2：3的比例，效果也不錯，酒石酸做酸源不容易吸濕，特別適合象重慶濕度較大的地區(qū)，而且崩解時限能完全符合規(guī)定，反應(yīng)速度不亞于枸櫞酸。只是酒石酸與鈣鎂離子相遇時，在水中會形成膠狀沉淀。為達到溶液澄清的目的，用PEG-6000和氯化鈉同時應(yīng)用代替硬脂酸鎂，溶液就能完全清澄。藥檢所在檢驗樣品時用的是超純水或蒸餾水，所以藥檢應(yīng)該是能通過的。二、維C泡騰片標(biāo)準(zhǔn)配方VC－－25％檸檬酸－－11％碳酸氫鈉－－35％羧甲基淀粉鈉－－8％乳糖－－12％阿斯巴甜－－1.5％甜橙香精－－1％PVP-K30－－4％PEG6000－－1％微粉硅膠－－1％硬脂酸鎂－－0.5％三、維C泡騰片配方潤滑劑的選擇泡騰片一般要求藥物成分是可溶性的，為保持崩解后溶液澄明，應(yīng)盡可能選用適宜的水溶性潤滑劑。泡騰片壓制生產(chǎn)過程中最容易出現(xiàn)的問題有：壓片機粘模粘沖泡騰后有沉淀不清澄口感欠佳泡騰崩溶時限泡騰片出現(xiàn)色斑片重差異大壓片機粘模粘沖除了泡騰片生產(chǎn)車間環(huán)境控制未達到要求外，也有泡騰片配方比例選擇的原因。在使用壓片機壓片過程中大多是使用硬脂酸鎂、滑石粉做潤滑劑，但做維C泡騰片所有原料和輔料都必須是溶于水的，因為硬脂酸鎂是疏水性物質(zhì)，不容于水，在維C泡騰片中使用硬脂酸鎂會產(chǎn)生混濁沉淀現(xiàn)象，建議不要用的或盡量少用。后來我們用PEG6000和微分硅膠兩種潤滑劑，微粉硅膠是助流劑，不是潤滑劑。助流劑的機理是填充顆粒間的空隙、填平顆粒粗糙的表面，增加流動性；潤滑的機理是降低片劑和壓片機沖模具之間的摩擦力，也會出現(xiàn)有沉淀現(xiàn)象。潤滑劑選用PEG較好，PEG6000的效果要好于PEG4000，建議用PEG6000，并增加氯化鈉，用量與PEG6000為2：3，PEG6000的用量為5％左右。其次，微粉硅膠、酒石酸、碳酸氫鈉，酒石酸與碳酸氫鈉在一起是很容易粘沖的，可以考慮將碳酸氫鈉用熔融的PEG包裹，冷卻后干燥、粉碎，再與主藥、酒石酸一起制粒，壓片機粘沖現(xiàn)象也就大大減輕了。后來將檸檬酸換成酒石酸或富馬酸后，效果較好無沉淀現(xiàn)象了。酒石酸代替檸檬酸，吸潮性會大大降低，但是口感就不如檸檬酸的好了。飲料里常加的矯味劑就知道了，用酒石酸的很少，那是因為口感不好。有些維C泡騰片生產(chǎn)廠家用硬脂富馬酸鈉，硬脂富馬酸鈉也是可溶的，但成本價格會高些。防粘模粘沖效果我們也比較過，基本上和硬脂酸鎂差不多。據(jù)我們多年來的粉末成型經(jīng)驗，在大山楂泡騰片的生產(chǎn)工藝中，曾經(jīng)指導(dǎo)過大山楂泡騰片生產(chǎn)廠家采用聚乙二醇的乙醇液同碳酸氫鈉混合，經(jīng)噴霧器形成細粉，聚乙二醇可將碳酸氫鈉包裹，避免與酸直接接觸，增加山楂泡騰片劑的穩(wěn)定性，同時解決了壓片時的粘沖問題。其實泡騰片中潤滑劑的選擇的確很頭痛。NaCl在力度伸泡騰片的處方上并不是做潤滑劑用的，而是做引濕劑！（只有用了它，才能在30秒內(nèi)崩解），在一般泡騰片中做潤滑劑效果不是很明顯。L-亮氨酸效果不錯，但價格偏高。使用時都必須過60目