高效薄層色譜HPTLC-

11儀器分析供藥學(xué)類、中藥學(xué)類、制藥工程及相關(guān)專業(yè)使用全國(guó)普通高等中醫(yī)藥院校藥學(xué)類專業(yè)“十三五”規(guī)劃教材（第二輪規(guī)劃教材）22第十二章經(jīng)典液相色譜法（LC）3經(jīng)典液相色譜法

LC31.平面色譜法概述4平面色譜法基本原理薄層色譜法紙色譜法第六節(jié)

平面色譜法4平面色譜法是指固定相呈平面狀態(tài)的色譜法。平面色譜法與柱色譜法的分離機(jī)理基本相同，操作方式有所區(qū)別。經(jīng)典柱色譜法的固定相填充于柱管中，流動(dòng)相靠重力作用流經(jīng)固定相，分離過(guò)程稱為洗脫，流動(dòng)相也稱洗脫劑；而平面色譜固定相涂布于平面載板上或以紙纖維為平面載體，流動(dòng)相通過(guò)毛細(xì)作用流經(jīng)固定相，分離過(guò)程稱為展開(kāi)，流動(dòng)相也稱展開(kāi)劑。本節(jié)主要介紹薄層色譜5

法與紙色譜法。5一、平面色譜法概述二、平面色譜基本原理·1.比移值（retardation

factor；Rff））圖1

2-8平面色譜展開(kāi)示意圖實(shí)際操作中，待測(cè)組分Rf

在0.2

~

0.8為宜。2.Rf與k的關(guān)系667·

可見(jiàn)Rf即柱色譜中的保留比R。7·

組分的k↑，在薄層上移動(dòng)速度↓，Rf

↓。若組分k為0，其Rf

=1，表示該組分完全不被固定相保留；若k為無(wú)窮大，其Rf=0，表示該組分在流動(dòng)相中濃度為0，完全被固定相保留，停留在原點(diǎn)，不能被展開(kāi)。3.影響Rf值的因素影響最大的是固定相、流動(dòng)相、組分的性質(zhì)及溫度等，此外，當(dāng)用同一種固定相、流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，被測(cè)物質(zhì)Rf

值還受下列因素的影響：：①固定相厚度。②展開(kāi)距離。③展開(kāi)容器中展開(kāi)劑蒸汽的飽和程度。④樣品量。⑤操作時(shí)的環(huán)境濕度和吸附劑含水量。4.相對(duì)比值（relative

retardation

factor，Rst）Rst是在一定條件下，待測(cè)組分比移值（Rf(i)）與參考物質(zhì)比移值（R

)）之比：f(s·

式中，Li，Ls分別為原點(diǎn)至待測(cè)組分i和參考物質(zhì)s斑點(diǎn)中心距離。Rst與Rf相比具有更好重現(xiàn)性和可比性。參考物質(zhì)可以選擇純物質(zhì)加到試樣中，也8

可以是試樣中的某一已知組分。Rst可以大于1，也可以小于1。89三、薄層色譜9固定相涂布于平面載板上，流動(dòng)相通常是借毛細(xì)管作用流經(jīng)固定相，使被分離后的物質(zhì)保留在固定相上?！_(kāi)放式的離線操作。見(jiàn)圖示特點(diǎn)適用于微量分析（微克級(jí)）；儀器簡(jiǎn)單，操作方便，靈敏度高，分析快速；具有多路柱效應(yīng)，可同時(shí)平行分離多個(gè)樣品；分離樣品所需展開(kāi)劑少，節(jié)約溶劑，減少了污染薄層色譜（TLC）nextback（一）概述．定義：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板 上，形成薄層而進(jìn)行色譜分離和分析的方法．操作過(guò)程：見(jiàn)圖示鋪板→活化→點(diǎn)樣→展開(kāi)→定位(定性)/洗脫(定量)3．分類：分離機(jī)制吸附、分配、離子交換、空間排阻經(jīng)典薄層色譜（TLC）、高效11

薄層色譜（HPTLC）、膠束薄層色譜（MTLC）next111212（二）吸附劑的選擇13根據(jù)被測(cè)物極性和吸附劑的吸附能力被測(cè)物極性強(qiáng)——活性低的吸附劑被測(cè)物極性弱——活性高的吸附劑選擇吸附劑主要依據(jù)樣品的性質(zhì)如：極性、酸堿性、溶解度等氧化鋁一般適用于堿性和中性物質(zhì)的分離硅膠微帶酸性適用于酸性和中性物質(zhì)的分離13（三）展開(kāi)劑的選擇劑14141、原則：要同時(shí)考慮固定相、流動(dòng)相、被分離物質(zhì)的性質(zhì)。2、選擇合適的Rf值（據(jù)展開(kāi)劑極性）3、選擇較好的選擇性（據(jù)溶的三角形分類）4、防止展開(kāi)劑脫混易脫混：多元溶劑極性差別大，極性溶劑比例小5、多元溶劑系統(tǒng)展開(kāi)劑不可重復(fù)使用圖示back（四）TLC的實(shí)驗(yàn)操作1s制板固定相：硅膠(硅膠Hs硅膠Gs硅膠GF254)sAl2O3s素s聚酰胺s葡聚糖凝膠s硅藻土等載板：軟板(聚酯薄膜)s硬板(玻璃板)粘合劑：CMC-Na

0.3～1%，常用0.5%鋪板方法

傾注法s浸漬法s機(jī)械涂布（自動(dòng)s手動(dòng)）（圖示）s噴涂法TLP的干燥:先自然干燥，后烘干活化

自然干燥時(shí)要陰干，否則吸附劑外孔間大量溶劑急劇揮發(fā)，溢出薄層面破壞表面平整，或由于突然受熱引起薄層局部收縮龜裂。板的厚度分析用：0.3～1mm；制備用:1～2mm?back預(yù)制板18定性分析—窄條定量分析—10×20cm硅膠G：自含粘和劑硅膠H：不含粘和劑，鋪板時(shí)另加入CMC硅膠HF254：含熒光劑，254

nm紫外光照發(fā)綠光硅膠HF365：含熒光劑，18

365

nm紫外光照發(fā)光表11-3192、點(diǎn)樣（1）控制點(diǎn)樣量，防止拖尾1-10μL·

點(diǎn)樣量=樣品溶液濃度×點(diǎn)樣體積（2）控制斑點(diǎn)大?。阂话阍?～3mm193、展開(kāi)（1）飽和展開(kāi)飽和展開(kāi)箱展開(kāi)是指在展開(kāi)前，箱內(nèi)的各種氣液達(dá)到平衡（和），展開(kāi)過(guò)程中，薄層上的溶劑不再蒸發(fā)，重現(xiàn)性好。（2）不飽和展開(kāi)不飽和展開(kāi)箱展開(kāi)是指展開(kāi)箱中氣體與溶劑蒸氣、薄層未達(dá)動(dòng)態(tài)平衡時(shí)即開(kāi)始展開(kāi)；展開(kāi)過(guò)程中，薄層上的溶劑不斷地薄層表面上蒸發(fā)，從而造成結(jié)果重現(xiàn)性差及邊緣效應(yīng)邊緣效應(yīng)：即同一種組分在同一塊板上，處于邊緣的點(diǎn)的Rf值大于中心點(diǎn)。

原因：a、邊緣處溶劑揮發(fā)快；b、多元溶劑時(shí)，易揮發(fā)溶劑在邊緣揮發(fā)快，從而難揮發(fā)溶劑（極性大）相對(duì)比例大洗脫能力強(qiáng)，使斑點(diǎn)移動(dòng)快。（3）展開(kāi)方式上行法、下行法、水平展開(kāi)。（4）特殊展開(kāi)技術(shù)連續(xù)展開(kāi)（相當(dāng)于增加展開(kāi)距離）單向多級(jí)展開(kāi)雙向展開(kāi)分級(jí)展開(kāi)（自動(dòng)多步展開(kāi)儀）2121·

4、檢出顯色、定位22有色物質(zhì)直接定位。無(wú)色物質(zhì)紫外光下定位（λ254，365）。熒光定位：發(fā)射熒光的物質(zhì)在熒光背景下顯暗斑的物質(zhì)（熒光熄滅）顯色定位（化學(xué)顯色）I2蒸氣（棕黃色）濃硫酸/MeOH（1:1）或10%H2SO4-乙醇溶液噴霧后，110℃烘烤22專屬顯色劑噴霧：人工、機(jī)械（五）定性分析1、比移值Rf、R（保留比）R’=

1 /（1+CsVs

/

CmVm）=1 /（1+KVs

/

Vm）Rst相對(duì)比移值圖12-8平面色譜展開(kāi)示意圖比移值Rf、R影響因素24色譜條件一定，Rf只與組分性質(zhì)有關(guān)，是薄層色譜基本定性參數(shù)，說(shuō)明組分的色譜保留行為。k大，則移動(dòng)慢，比移值小,Rf↓；正相薄層板，對(duì)于極性組分v

展開(kāi)劑極性↑大，Rf↑大（容易洗脫）v

展開(kāi)劑極性↓小，Rf↓?。ú蝗菀紫疵摚㏑f范圍：0<Rf

<1（組分遷移速度和距離小于展開(kāi)劑遷移速度和距離）24Rf

=0.2～0.8（常用）；0.3～0.5（最佳）2、流動(dòng)相的速率25與柱色譜相比，TLC、PC中，流動(dòng)相的速率是不恒定的，展距越大，速率越小。3、固定相的變化平面色譜操作大多是敞開(kāi)的，與大氣接觸，與柱色譜不同。在上樣時(shí)，吸附薄層會(huì)吸收空氣中的水或減活，從而造成結(jié)果不重現(xiàn)。25定性26Rf值定性影響Rf值的因素：飽合程度、濕度、溫度多種溶劑系統(tǒng)定性改變：a、極性b、酸堿性c、種類（組別）

d、正向、反相色譜26（六）定量27直接測(cè)定目測(cè)斑點(diǎn)面積薄層掃描TLCS間接測(cè)定（洗脫測(cè)定）分離后刮下相應(yīng)的固定相，用溶劑將組分洗下，進(jìn)行紫外測(cè)定27。（七）薄層掃描法（

TLCS）28薄層掃描法基本原理:樣品經(jīng)薄層分離后直接測(cè)定或經(jīng)適當(dāng)處理使之顯色或產(chǎn)生熒光，在特定波長(zhǎng)下，用光度計(jì)測(cè)其吸光度或熒光強(qiáng)度的方法稱為薄層掃描法。薄層掃描儀測(cè)定方法：吸收測(cè)定法（UV-Vis）、熒光測(cè)定法281、吸收測(cè)定法29利用可見(jiàn)光或紫外光照射展開(kāi)后的薄層，測(cè)定色譜斑點(diǎn)的吸光度A隨展開(kāi)距離L的變化，得到A-L或A-Rf

曲線，即薄層掃描圖。色譜峰面積，可用于定量分析。由于薄層板存在明顯的散射和反射現(xiàn)象，所以斑點(diǎn)中組分濃度與A的關(guān)系不服從Beer定律，需要Kubelka-munk理論來(lái)描述。理想空白薄層板的單位薄層厚度的吸光系數(shù)K=0，實(shí)際上，K≠0，為消除此影響，以空白板為基準(zhǔn)，測(cè)定空白透光率或反射率來(lái)計(jì)算2斑9

點(diǎn)的吸光度。·

透射法透光率：A=-lgT/T0空白板和斑點(diǎn)·

反射法（常用）空白板和斑點(diǎn)T0=i0/I0

；

T=i/I0反30射率：A=-lgR/R0R0=j0/I0；R=j/I0302、熒光測(cè)定法31熒光：某些物質(zhì)吸收特定波長(zhǎng)的光后，除產(chǎn)生吸收光譜外，還會(huì)發(fā)射比原來(lái)吸收波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光。靈敏度高，但適用范圍窄，要求組分發(fā)射熒光（衍生）F=ФI0

abcI0：入射光強(qiáng)度

b：薄層厚度Ф：熒光效率a：吸光系數(shù)31c：樣品濃度323、掃描方式32直線形掃描：光束以直線軌跡通過(guò)色斑，光束應(yīng)將整個(gè)色斑包括在內(nèi)。適用于外形規(guī)則的斑點(diǎn)。鋸齒形掃描：光束呈鋸齒狀軌跡移動(dòng)。適用于外形不規(guī)則及大的色斑。4、定量方法外標(biāo)法外標(biāo)一點(diǎn)法外標(biāo)兩點(diǎn)法2）內(nèi)標(biāo)法33331、高效薄層色譜（HPTLC）固定相粒度：5～10μm分離度高、靈敏度高、展開(kāi)時(shí)間短經(jīng)典薄層板與高效薄層板的比較經(jīng)典薄層高效薄層點(diǎn)樣體積1～5μl100～500nl溶液濃度0.01～1.00%原點(diǎn)直徑5mm(3mm3m4)1～2mm起始線距底邊距離1.5cm1cm展距10～15cm5～7cm點(diǎn)與點(diǎn)間距1～2cm0.5cm固定相顆粒直徑10～40μ3m4(20μm)5～10μm(7μm)（八）特殊薄層色譜法2、膠束薄層色譜

當(dāng)表面活性劑水溶液超過(guò)一定濃度（臨界膠束濃度CMC）時(shí)，多余的表面活性劑不再溶解，而聚集成膠束，成為膠體分散體系；由于被分離物質(zhì)在水、膠束、固定相三者之間相互作用（分配系數(shù)、靜電作用、空間效應(yīng)等）而具有很好的選擇性。

作為流動(dòng)相的表面活性劑，具有疏水基和親水基團(tuán)，在水溶液中，其分子可聚集在一起，形成親水基向外、疏水基向內(nèi)（或相反）的締合體，即膠束。膠束的存在能使不溶或微溶于水的有機(jī)化合物的溶解度增加

流動(dòng)相用低濃度表面活性劑的水溶液或含有少量水的非極性有機(jī)溶液固定相：多用聚酰胺板或薄膜；其次為氧化鋁，硅膠板較少應(yīng)用表面活性劑：陰離子：十二烷基硫酸鈉（SDS）

陽(yáng)離子：十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC）兩性：十八烷基二甲基甜菜堿；十二烷基氨基丙酸鈉以濾紙做載體，以構(gòu)成濾紙的纖維素所結(jié)合水分為固定液，以有機(jī)溶劑為展開(kāi)劑的色譜分析方法。固定相：紙纖維吸附的水流動(dòng)相：有機(jī)溶劑（乙醇、丙醇、丙酮）或水討論：Rf

與組分性質(zhì)、流動(dòng)相及溶解度有關(guān)：36極性組分→易保留，Rf?。鲃?dòng)相極性↑，Rf

）36非極性組分→易流出，Rf大（流動(dòng)相極性↑，Rf