發(fā)酵工藝學(xué)課件：第九章 發(fā)酵生產(chǎn)實例1

第九章發(fā)酵生產(chǎn)實例第一節(jié)抗生素發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)1.概述抗生素是微生物或其他生物生命活動過程中合成的次生代謝產(chǎn)物或其人工衍生物，它們在很低濃度時就能抑制或干擾它種生物的生命活動。SirAlexanderFlemingdiscoveredtheantibioticpenicillin.Hehadtheinsighttorecognizethesignificanceoftheinhibitionofbacterialgrowthinthevicinityofafungalcontaminantwhenmostotherscientistsprobablywouldhavesimplydiscardedthecontaminatedplates.AlexanderFleming(1881-1955)青霉素的發(fā)現(xiàn)者及1945年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎獲得者AlexanderFleming(1881-1955)ErnstB.

Chain(1906-1979)HowardW.

Florey(1898-1968)SelmanA.Waksman(1888-1973)——獲1952年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎1942年Waksman從放線菌中分離出了鏈霉素根據(jù)抗生素的作用機制分類抑制細胞壁合成：青霉素抑制細胞膜功能：多肽類抗生素抑制蛋白質(zhì)合成：四環(huán)素抑制核酸合成：絲裂霉素

分類Classification復(fù)制翻譯轉(zhuǎn)錄根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類β-內(nèi)酰胺類：青霉素類(penicillins)

頭孢菌素類(cephalosporins)氨基糖苷類：鏈霉素、慶大霉素大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、麥迪霉素四環(huán)類：四環(huán)素、土霉素多肽類：多粘菌素類亞類主要品種b-內(nèi)酰胺類(b-Lactams)青霉烷類頭孢烯類氧頭孢烯類碳頭孢烯類青霉烯類碳青霉烯類單環(huán)內(nèi)酰胺類

-內(nèi)酰胺酶抑制劑青霉素G，青霉素V，氨芐西林，阿莫西林，······頭孢噻吩，頭孢唑啉，頭孢氨芐，頭孢羥氨芐，······拉氧頭孢，氟氧頭孢氯碳頭孢瑞替配能，法羅配能亞胺配能，帕尼配能，美洛配能，比阿配能氨曲喃，卡魯莫喃棒酸，舒巴坦，三唑巴坦，舒他西林，三唑配能類亞類主要品種氨基糖苷類(Amino-glycosides)天然半合成鏈霉素，卡那霉素，慶大米星(慶大霉素)，小諾米星(小諾霉素)，核糖霉素，妥布霉素，紫蘇霉素，阿斯米星(福提霉素)，大觀霉素，新霉素，春日霉素，有效霉素半合成卡那霉素：阿貝卡星，阿米卡星，地貝卡星；半合成紫蘇霉素：奈替米星；半合成慶大霉素：衣替米星類亞類主要品種大環(huán)內(nèi)酯類(Macro-lactones)14員環(huán)15員環(huán)16員環(huán)>20員紅霉素，竹桃霉素，半合成紅霉素克拉霉素、羅紅霉素、地紅霉素、氟紅霉素阿齊霉素(半合成紅霉素)柱晶白霉素(北里霉素)，交沙霉素，麥迪霉素，羅他霉素(丙酰柱晶白霉素)，乙酰螺旋霉素和丙酰螺旋霉素(半合成螺旋霉素)，三岡霉素(半合成麥迪霉素)，泰洛菌素，除蟲菌素，雙氫除蟲菌素(半合成除蟲菌素)，環(huán)氧噻酮藤霉素(他克莫司)，雷帕霉素(昔洛莫司)

HNONSCH3CH3HCOO-H青霉素母核：6-氨基青霉烷酸(6-APA)R頭孢菌素母核：7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）阿莫西林Amoxicillin又名羥氨芐青霉素主要的抗藥機制產(chǎn)生修飾抗生素的酶：修飾b-內(nèi)酰胺抗生素的b-內(nèi)酰胺酶，修飾氨基糖苷抗生素的乙?；?、磷酸化酶和腺苷化酶。修飾自身的藥物作用靶：改變青霉素結(jié)合蛋白，降低細胞壁前體對萬古霉素的親和性。減少藥物的攝入或強化藥物的排出：降低細胞膜的通透性而對氨基糖苷及碳青霉烯抗生素耐藥，增強藥物排出泵的活力而對四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及喹諾酮類抗生素耐藥。病原菌對抗生素產(chǎn)生的抗藥性當(dāng)青霉素進入到某些細菌體內(nèi)的時候，不僅和青霉素結(jié)合蛋白親密接觸，還會觸動細菌體內(nèi)埋伏的某種基因機關(guān)。一些特定的蛋白和青霉素結(jié)合之后，一段基因編碼將啟動細菌的加工系統(tǒng)。大量具有特殊功能的蛋白質(zhì)被迅速合成。這些蛋白質(zhì)貫穿細胞膜，消耗能量，捕獲細胞內(nèi)的青霉素，然后將其驅(qū)逐到細胞之外?？顾幮缘念A(yù)防開發(fā)新抗生素及對已有抗生素進行結(jié)構(gòu)改造；用抑制耐藥機制的藥物與抗生素組成復(fù)方；開發(fā)預(yù)防病原菌感染的疫苗；改善環(huán)境衛(wèi)生，加強醫(yī)院病原體及廢棄物的無害化管理，阻斷病原菌傳播；對癥用藥，除惡務(wù)盡，不濫用抗生素。產(chǎn)生菌的育種、篩選抗菌性試驗提取、精制、鑒定毒性試驗藥理和臨床試驗

2．生產(chǎn)前期研究ResearchinLab

Agardiffusionassayagarplate瓊脂培養(yǎng)基lawnoftestbacteria測試菌苔filterpaperssoakedwithtestcompounds含藥物濾紙zonesofinhibition(nogrowth)

抑菌圈人工誘變法：紫外線、X-線、γ-線照射亞硝基胍、亞硝酸、秋水仙素、氮芥等誘變劑處理3.抗生素生產(chǎn)菌改良StrainImprovement基因工程GeneticEngineering

3.抗生素生產(chǎn)菌改良StrainImprovementRecombinantDNATechnology（DNA重組技術(shù)）克隆青霉素菌種改良Fleming—點青霉,適用固體發(fā)酵2U/ml1943,美國甜瓜分離的產(chǎn)黃青霉利于液體發(fā)酵120U/ml—誘變—Wisconsis菌株WisQ176

900U/ml—Wis.B13-D10無色素誘變，提高產(chǎn)量，目前已超過80,000U/ml。StrainImprovementScale-up出發(fā)菌株平板技術(shù)搖瓶培養(yǎng)二級搖瓶培養(yǎng)各種培養(yǎng)基

小型發(fā)酵罐模擬生產(chǎn)條件MastercellbankWorkingcellbank菌種擴大培養(yǎng)中試生產(chǎn)生產(chǎn)3003031Possiblerecycle搖瓶發(fā)酵裝液量：10%(~250ml)間歇培養(yǎng)溫控受限制代謝碳水化合物慢緩沖液控制pH在線取樣難容量減少瓶壁上結(jié)垢無需消泡攪拌受限制無法控制溶解氧10-100,000升容量補料培養(yǎng)連續(xù)控制：pH，溫度需要銨鹽或氨氣無需緩沖液在線取樣易補料,容量增加生長均勻一致需消泡攪拌控制溶解氧:通氣,加壓攪拌罐發(fā)酵→種子制備

→發(fā)酵

→發(fā)酵液預(yù)處理→提取及精制→成品包裝4.抗生素生產(chǎn)工藝過程Aschemeofthematerialflowinanantibioticproduction發(fā)酵罐緩沖罐種子罐發(fā)酵生產(chǎn)原料

碳源:乳糖、蔗糖、葡萄糖甜菜和甘蔗糖蜜淀粉乙醇，甲醇甘油麥芽糖漿，玉米糖漿綿籽油，花生油，豆油豬油油酸甲酯油脂氮源:玉米漿、綿籽粉大豆粉花生粉菜籽粉牛血，酪蛋白水解液乳清魚粉酵母酵母膏肉粉和骨粉

發(fā)酵生產(chǎn)原料發(fā)酵控制

SampleAnalysisDOSugarAmmoniaPhosphateSulphateProductsPrecursorsContaminationpHPressureprobeLevelprobepHprobeTemp.probeDOprobeAntifoamAcid/BaseCoolingAir/agitationSugar/Oilfeed青霉素生產(chǎn)菌種——產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)的分生孢子4.1青霉素生產(chǎn)工藝過程

培養(yǎng)基ComponentsRange%組成Glucose/sucrose3.0-5.0葡萄糖/蔗糖Starch淀粉3.0-5.0玉米浸提液

3.0-5.0碳酸鈣0.5-1.0Phosphate磷酸鹽0.1-0.5Ammoniumsulphate0.1-1.0

硫酸銨Urea尿素0.1-0.5Oil油0.1-0.5發(fā)酵培養(yǎng)基

ComponentsRange%組成Glucose葡萄糖0.5-1.0Starch淀粉0.5-5.0玉米浸提液5.0-8.0

豆餅粉1.0-5.0Phosphate0.1-1.0Ammoniumsulphate0.5-1.0andfedperiodicallyOil1.0andfedcontinuously種子培養(yǎng)基ScaleWeightSignalPumpSpeedAmplifierControllerSupervisoryComputer

FlowRateControl流量控制發(fā)酵控制Fermentationcontrol青霉素的生產(chǎn)菌種(strain)：產(chǎn)黃青霉菌(Penicilliumchrysogenum)孢子培養(yǎng)(sporecultivation)：25oC,6-7d種子培養(yǎng)(seedcultivation)：25oC，2-3d發(fā)酵培養(yǎng)(fermentation)：22-26oC,6-7d加糖控制(sugarfeeding)：殘?zhí)墙抵?.6％

青霉素發(fā)酵總體流程補氮(nitrogenfeeding)：氨控制在0.01-0.05％,補

硫酸銨、氨水或尿素。前體(precursor)：殘余苯乙酰胺0.05-0.08％溫度控制(temperature)：前期25-26oC(菌絲生長)后期23oC(分泌青霉素)通氣與攪拌(aeration&stir)：1:0.8VVM泡沫(foam)：天然油脂,如豆油控制鐵離子濃度，小于30μg/ml分離：過濾—醋酸丁酯萃取、脫色—過濾—結(jié)晶青霉素發(fā)酵總體流程發(fā)酵中不加側(cè)鏈前體時，產(chǎn)生多種N-?；〈那嗝顾?，青霉素G、青霉素X、青霉素F、青霉素K、青霉素V等。青霉素G、青霉素V有臨床給藥價值，青霉素V可口服。HNONSCH3CH3HCOO-H青霉素母核：6-氨基青霉烷酸(6-APA)RPenicillinFermentationProfile變化曲線4.2頭孢菌素C的生產(chǎn)生產(chǎn)菌種：枝頂頭孢（Cephalosporiumacremonium），又稱產(chǎn)黃枝頂孢。生產(chǎn)流程：枝頂頭孢→斜面培養(yǎng)→搖瓶培養(yǎng)種子罐→發(fā)酵→過濾→超濾→結(jié)晶→過濾干燥→頭孢菌素鋅鹽工藝控制點：氨氮：0.5~0.7g/L；pH：~6.5。原料消耗：10~20氨30~120糖17~23無機鹽70~130豆油50~75玉米漿80~160氧消耗量(kg/m3發(fā)酵液)物質(zhì)名稱消耗量(kg/m3發(fā)酵液)物質(zhì)名稱Cephalosporiumacremonium的氣生菌絲4.3棒酸的工業(yè)生產(chǎn)生產(chǎn)菌種：帶小棒鏈霉菌（Streptomycesclavuligerus）生產(chǎn)流程：帶小棒鏈霉菌孢子→斜面培養(yǎng)→搖瓶培養(yǎng)→種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵

→冷卻→過濾→離子交換→萃取→結(jié)晶→重結(jié)晶→成鹽→棒酸鉀沉沒培養(yǎng)的鏈霉菌(Streptomyces)菌絲4.4紅霉素的發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)生菌：紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)菌種選育：表達透明顫菌(Vitreoscillasp.)血紅蛋白(VHB)基因工程菌可減少氧的需要，提高產(chǎn)量。發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源——淀粉，蔗糖，葡萄糖，植物油；氮源——豆餅粉，花生餅粉，棉籽餅粉，硫酸銨；前體——丙酸或丙醇；無機鹽——磷酸鹽，硫酸鎂等。發(fā)酵過程控制：碳/氮比、磷酸根和氨氮濃度；前體——通過流加方法控制。紅霉素的提取：發(fā)酵液→調(diào)pH→醋酸丁酯萃取→結(jié)晶→干燥5.天然抗生素的改造抗耐藥菌、降低毒性、提高療效青霉素的改造：過敏、不易口服、耐藥保留母核(6-APA)對R基團改造芐青霉素為原料，以青霉素?；高M行裂解后制取6-APA。將6-APA與化學(xué)合成側(cè)鏈進行酶法催化，得到半合成青霉素。

HNONSCH3CH3HCOO-H青霉素母核：6-氨基青霉烷酸(6-APA)R頭孢菌素母核：7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）的生產(chǎn)

D-氨基酸氧化酶（Trigonopsisvariabilis,Fusariumsolani）

脫羧

GL-7-ACA酰胺酶（Pseudomonassp.)頭孢菌素Ca-酮己二酰-7-氨基頭孢烯酸

戊二酰-7-氨基頭孢烷酸

(GL-7-ACA)7-ACA幾種半合成b-內(nèi)酰胺抗生素的酶法合成苯甘氨酸甲酯6-APA轉(zhuǎn)酰基酶轉(zhuǎn)?；皋D(zhuǎn)酰基酶苯乙醇酸甲酯

苯甘氨酸甲酯7-ADCA7-TACA

氨芐西林

頭孢氨芐

頭孢羥唑

+++課堂匯報及討論開發(fā)、設(shè)計一種微生物工程產(chǎn)品3-6人為一小組，查閱資料說明項目的市場需求及國內(nèi)外現(xiàn)狀投資、產(chǎn)值、可行性、需要設(shè)備及條件生產(chǎn)的主要技術(shù)流程、廢棄物處理等情況每位同學(xué)都能夠回答其他同學(xué)的提問小組成績?yōu)槊课煌瑢W(xué)的成績，計入平時成績將相關(guān)材料及PPT發(fā)到我郵箱yhyi1@一、b-內(nèi)酰胺抗生素的分類青霉烷(penams)青霉烯(penems)碳青霉烯(carbapenems)頭孢烯(cephems)碳頭孢烯

氧頭孢烯

單環(huán)

-內(nèi)酰胺

氧青霉烷

(棒烷)青霉烷砜(carbacephems)(oxocephems)(monobactams)(oxopenams)(penicillanicacidsulfone)第三章b-內(nèi)酰胺抗生素

第四節(jié)青霉素的工業(yè)生產(chǎn)青霉素發(fā)酵過程主要變量的典型變化曲線第三章b-內(nèi)酰胺抗生素

第四節(jié)青霉素的工業(yè)生產(chǎn)

青霉素生產(chǎn)工藝要點（一）

生產(chǎn)菌種的長期保存要采用孢子懸浮液液氮低溫（-196℃）存放或真空冷凍干燥管冷藏（4℃）的方法，而不采用傳統(tǒng)的沙土管保藏方法，以便在較長時間（5~10年）內(nèi)保持菌種的存活和生產(chǎn)能力穩(wěn)定。瓊脂斜面種子（孢子）密封后在4~15℃下可以短時間保存，但最好不要超過3個月。米孢子的基質(zhì)可以是大米或小米，培養(yǎng)成熟后密封可以在4~15℃下保存不超過3個月；如果在密封前真空干燥，則可以保存不超過6個月。種子罐以達到對數(shù)生長的后期為培養(yǎng)成熟指標(biāo)，不能隨意延長或縮短培養(yǎng)時間；同時要考慮培養(yǎng)液的流動性，以不影響通過管道向發(fā)酵罐接種的速度為宜。第三章b-內(nèi)酰胺抗生素

第四節(jié)青霉素的工業(yè)生產(chǎn)

青霉素生產(chǎn)工藝要點（二）發(fā)酵罐的發(fā)酵條件要嚴格按工藝要求進行控制，特別是各項補料要適應(yīng)工藝對溶氧、pH及維持量的要求，不能過量，也不能不足；為了減少過程空氣濕度對發(fā)酵液體積的影響，在濕度偏高或偏低的季節(jié)，要適當(dāng)提高或降低用于補料的糖液濃度。氨水既作為發(fā)酵的氮源，又用來調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH，它的補入要根據(jù)發(fā)酵液的pH和銨氮含量與補硫酸銨協(xié)調(diào)進行。發(fā)酵液過濾要盡量提高速度，縮短時間，為此一般需要在過濾前對發(fā)酵液進行絮凝處理，絮凝劑的加入量隨絮凝劑種類不同而異，以達到最大絮凝效果而不過量為宜。除種子制備和發(fā)酵過程要嚴防雜菌侵入外，提取的各工序也應(yīng)盡量保持無菌，因為污染細菌極有可能產(chǎn)生能破壞青霉素的青霉素酶；特別是過濾，由于操作時間長，料液營養(yǎng)豐富，容易滋生雜菌，故必須定期對設(shè)備和過濾介質(zhì)進行清洗和滅菌，必要時可在過濾前加入4‰福爾馬林防腐。第三章b-內(nèi)酰胺抗生素

第四節(jié)青霉素的工業(yè)生產(chǎn)

青霉素生產(chǎn)工藝要點（三）青霉素對熱、酸、堿都不穩(wěn)定，而萃取操作正好處于不穩(wěn)定pH范圍內(nèi)，故萃取過程要盡量降低溫度，縮短時間，以減少青霉素的降解；離心萃取速度快，青霉素在不穩(wěn)定pH下維持時間短，是